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玉米C型不育胞质（C-type cytoplasmic male sterility,CMS-C）花粉败育彻底、不育性状稳定,在玉米杂交制种应用上具有较好的推广前景。然而,育性恢复机制复杂、强恢复系的缺乏是CMS-C进一步推广应用的主要制约因素。Rf4作为玉米CMS-C的主效恢复基因,可以恢复大部分C胞质不育系,在育种中具有较大的应用潜力,但Rf4目前未被克隆验证,其功能机制尚不清晰。为解析Rf4介导的玉米CMS-C育性恢复机制及鉴定含有Rf4的新恢复系,本研究主要包括两方面内容:一是通过探究Rf4候选基因ZmbHLH16的分子功能并结合Rf4位点的近等基因系基因组及转录组数据分析,以解析CMS-C的育性恢复机制;二是采用恢保关系测定、遗传分析、分子标记定位及等位性测定等方法,对18份自交系Rf4位点的基因型进行分析,旨在进一步挖掘具有Rf4基因的强恢复系,为相关研究及生产应用提供基础材料。主要研究结果如下:1.对4份CMS-C不育系（rf4rf4）与5份恢复系（Rf4Rf4）Rf4的候选基因ZmbHLH16基因组全长序列进行比较,总共检测到34处核苷酸变异,其中S1596位点（TTT/TAC）变异具有一定规律性:在恢复系中此位点都为TTT、编码苯丙氨酸,而在不育系中都为TAC、编码酪氨酸。基于此变异位点,进一步的等位性测验结果显示,在S1596位点为TTT的28份自交系与A619（Rf4Rf4）或广10-2（Rf4Rf4）所组配的等位性测定群体全部不发生育性分离、都为可育株,而S1596位点为TAC的10自交系所组配的等位性测定群体中,有9份自交系对应的等位性群体同时出现可育株与不育株、发生育性分离,仅SAM1001与A619组配的等位性测验群体不发生育性分离、全为可育株。以上结果表明转录因子ZmbHLH16的S1596位点变异与Rf4恢复功能密切相关。最后,基于S1596位点变异开发了CAPS标记,扩增产物约为360 bp,在S1596为TAC时,PCR产物可经内切酶Tat I消化得到两条片段,大小分别为260 bp和100 bp;而在S1596为TTT时,PCR产物不能被Tat I内切酶识别,该CAPS标记的开发有助于Rf4的转育及其恢复系的鉴定。2.克隆了Rf4的候选基因ZmbHLH16的编码区,发现它具有典型的bHLH结构域。酵母中的转录激活活性分析表明ZmbHLH16全长蛋白不具有转录激活活性。通过蛋白截短试验,发现ZmbHLH16 N端前80个氨基酸区域具有转录激活活性,而其第161-365位氨基酸可能具有抑制转录激活活性的功能。酵母单杂交分析显示ZmbHLH16蛋白不能与G-box元件（CACGTG）的结合。共表达分析发现全基因组范围395个基因与ZmbHLH16表达特征相似,其中有72和54个基因可分别定位于线粒体和叶绿体中。荧光定量分析显示ZmbHLH16和玉米雄性生殖发育相关的转录因子ZmbHLH51、ZmbHLH122和Zm MYB74都主要在花药的小孢子单核期及双核早期表达。水稻原生质体中瞬时表达显示ZmbHLH16、ZmbHLH51、ZmbHLH122三个bHLH蛋白主要定位于细胞核。酵母双杂交表明ZmbHLH16能够分别与ZmbHLH51、ZmbHLH122、Zm MYB74三个转录因子互作,ZmbHLH51能够与Zm MYB74互作。此外,酵母双杂交结果显示ZmbHLH16的bHLH结构域能够与ZmbHLH51互作,而其不包含bHLH结构域的区段包括第81～160、241～365位氨基酸也能够直接与ZmbHLH51形成二聚体。3.对用于构建Rf4位点近等基因系的回交群体的雄穗育性在多年多点进行调查,发现不同世代回交群体中可育株与不育株育性分离比都符合1:1。同时,Rf4连锁分子标记检测发现回交群体BC5F1植株雄穗育性与Rf4位点基因型共分离。以上结果表明近等基因系NIL＿Rf4雄蕊育性主要受Rf4控制。对近等基因系可育NIL＿Rf4与不育NIL＿rf4进行全基因组重测序分析,发现它们的基因组差异主要位于第8染色体短臂末端0～1 Mb,该区域正是Rf4的定位区间,这说明成功构建了Rf4位点的近等基因系。此外,对未比对到参考基因组的Clean reads进行拼接组装,总共鉴定了2,890个新基因,其中包括1个PPR基因及645个线粒体靶向基因,上述鉴定的新基因有助于Rf4候选基因的挖掘。4.对近等基因系小穗进行转录组测序分析,在可育NIL＿Rf4与不育NIL＿rf4之间总共鉴定了7,125个差异表达基因。对所有差异表达基因进行GO聚类分析,发现它们主要参与代谢（metabolic process）、细胞代谢（cellular process）和单组织代谢（single-organism process）等生物学过程,差异表达基因的分子功能主要涉及结合（binding）和催化活性（catalytic activity）,其中有100个差异表达基因参与了花粉管发育（GO0048868）、花粉管生长（GO0009860）、花粉发育（GO0009555）和配子体发育（GO0048229）等4个与花粉形成直接相关的GO条目。对全部差异表达基因进行KEGG通路分析,发现它们主要参与碳代谢和能量代谢等通路,其中有58个差异表达基因参与了能量代谢中糖酵解、磷酸戊糖途径及丙酮酸代谢过程。转录组测序分析发现有14个差异表达基因参与了线粒体三羧酸循环,并且转录组数据及荧光定量分析结果显示它们全部在可育NIL＿Rf4中上调表达,而在不育NIL＿rf4下调表达。在上述14个差异表达基因中,有6个基因参与形成酮戊二酸脱氢酶复合体,有3个基因参与形成异柠檬酸脱氢酶复合体。酶联免疫吸附试验结果表明,可育NIL＿Rf4小穗中酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶两种酶的含量都要显著高于不育NIL＿rf4中的含量。以上结果表明线粒体三羧酸循环与玉米CMS-C育性恢复密切相关,而其中酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶较为关键。5.克隆了5个参与玉米线粒体三羧酸循环的差异表达基因,包括琥珀酰辅酶A合成酶基因GRMZM2G064695、酮戊二酸脱氢酶基因GRMZM2G079538、异柠檬酸脱氢酶基因GRMZM2G120857、顺乌头酸酶基因GRMZM2G176397和苹果酸脱氢酶基因GRMZM2G466833。首先,将它们在烟草叶片中进行瞬时表达进行亚细胞定位分析,发现它们的蛋白产物主要定位于线粒体,但GRMZM2G079538与GRMZM2G176397两个基因的蛋白产物同时也分布在细胞核中。接下来,利用双分子荧光互补技术探究了上述5个基因之间的互作关系,发现GRMZM2G176397与GRMZM2G466833可分别形成同源二聚体,并且同源二聚体主要分布于线粒体中,然而并未发现这5个基因之间可形成异源二聚体。最后,分别构建了上述5个基因的过表达拟南芥株系,发现GRMZM2G120857的过表达植株育性相比于野生型出现降低,而其它4个基因的过表达植株育性未发生明显变化。6.恢保关系测定结果显示,在18份测验系中,有10份自交系能够完全恢复CMS-C不育系C黄早四的育性。将完全恢复F1自交形成F2群体,对F2群体育性分离情况进行统计分析,发现DAN598、PHT77、78551S和LH212Ht四份材料仅含1对主效恢复基因,PHN82含2对主效恢复基因。利用分子标记将DAN598、PHT77、78551S和LH212Ht四份自交系中的恢复基因定位于第8染色体短臂末端。等位性测验结果显示,包括DAN598、PHT77、78551S、LH212Ht、PHN82等在内的12份自交系中恢复基因与A619中的恢复基因等位。综合以上研究结果,可以推定DAN598、PHT77、78551S、LH212Ht四份材料是含有Rf4的CMS-C恢复系。