研究背景；副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)又名致病性嗜盐菌,是一种革兰氏阴性细菌,广泛存在于河口、海洋和海岸环境中。副溶血弧菌是一种海产源性的致病菌,感染的主要途径是由于食用了未煮熟的受污染的海产品,尤其是贝类。在世界范围内,副溶血弧菌是引起旅行者腹泻和肠胃炎的主要原因。广东省地处沿海,海产品消费量较大,因此副溶血弧菌对公共卫生及商业效益所造成的影响也不容忽视。现根据菌体O抗原和荚膜K抗原的不同,可分为13个热稳定O抗原群(01～013),71种热不稳定K抗原(K1～K71),但也存在许多不能被血清分型的菌株。副溶血弧菌主要分为两类,一类是非致病性的副溶血弧菌,另一类是致病性的副溶血弧菌。几乎所有的环境分离株都是非致病性的,而临床患者的分离株则是致病性的。副溶血弧菌本身具有多种致病的毒力因子,目前认为它主要的致病因子有：耐热直接溶血毒素(TDH)、耐热相关溶血毒素(TRH)、尿素酶、毒力岛和Ⅲ型分泌系统。新的03：K6型副溶血弧菌首先于1996年在印度的加尔各答(Calcutt a)地区得到分离和鉴定。在随后几个月的副溶血弧菌感染病例中,此血清型占到了50-80%。所有的03：K6型分离株均为tdh+trh-型菌株,并且具有一致的基因型。随后在印尼、越南、孟加拉国、日本、韩国和泰国等地也发现了相同血清群的菌株。根据toxRS位点的核苷酸变异找到了特异性识别新克隆株的方法,在应用这种方法的过程中发现有些分离株即使血清型不同,但都可被归入“新的”03：K6克隆群中。并在随后几年陆续发现了约21种血清型,主要有：O4:K68、O1:K25, O1:K41,和O1:KUT。这些血清型虽然与03：K6型菌株在O、K抗原上有差别,但具有相同的分子特征和基因型,因此将这些菌株统称为“大流行菌群”。到2006年为止,在欧洲、莫桑比克、美国等地都分离出了03：K6和它的衍生血清型菌株,“大流行菌群”的出现使得副溶血弧菌成为威胁全球公共卫生健康的重要致病菌。多位点序列分析(Multilocus Sequence Typing, MLST)是通过对所选择的管家基因来进行序列分析,来分析菌株的变异情况。这已成为对细菌病原体进行分子流行病学和种群遗传研究的重要工具。MLST是以核苷酸序列为基础,结果易于确认、储存和通过网络的方式共享,有利于世界各地实验室之间的相互比较。通过多位点序列分析研究,可以更好地了解一个物种内各菌株间的基因联系,并确定在进化过程中发挥相对重要的基因重组和横向转移事件。Gonzalez-Escalona等人在对全球100株副溶血弧菌菌株进行研究后开发了一套成功的针对副溶血弧菌的MLST实验方案。本研究通过对广东省2007-2013年腹泻病例副溶血弧菌分离株的血清型别、毒力基因携带情况以及MLST基因分型结果进行分析,以更好地了解副溶血弧菌的种群结构、流行情况、以及种群进化关系,为副溶血弧菌所引发的食源性疾病的监测和防控提供数据支持。研究目的：1.了解广东省2007-2013年腹泻病例副溶血弧菌分离株的血清型别和毒力基因的分布情况,掌握副溶血弧菌流行的优势血清型及致病性副溶血弧菌的分布情况。2.了解广东省2007-2013年腹泻病例副溶血弧菌分离株中“大流行菌群”的分布情况,确定广东地区是否存在副溶血弧菌的优势克隆群。3.了解广东省2007-2013年腹泻病例副溶血弧菌分离株的种群结构及进化关系。研究方法：1.菌株来源：本研究所使用的副溶血弧菌菌株均来源于广东省疾病预防控制中心2007-2013年通过食源性疾病监测网络所收集得到的腹泻病例分离株,共469株。收集范围涵盖广东省内15个地级市。所有菌株均经广东省疾病预防控制中心病原微生物检验所进行复核鉴定后,冷冻干燥保存于-70℃的环境下。2.血清学分型：将副溶血弧菌于3% NaCl TSA斜面上37”℃培养24h。挑选菌群,使用副溶血弧菌血清试剂盒进行菌体抗原(O)与荚膜抗原(K)的凝集试验。3.毒力基因检测：采用PCR扩增的方法检测tdh和trh、GS-PCR和orf8基因。副溶血弧菌“大流行菌群”的判定标准为：①1996年以后分离；②TDH阳性；③TRH阴性；④GS-PCR(group-specific PCR)阳性和/或orf8阳性。4.MLST：挑取150株具有代表性的菌株对其7个管家基因(housekeeping genes, HK genes)进行PCR扩增和基因测序。7个等位基因分别为：dnaE(编码DNA聚合酶Ⅲ，α亚基)、recA(编码RecA蛋白)、gyrB(编码DNA解旋酶,B亚基)、dtdS(编码2-氨基-3羟基丁酸脱氢酶)、pntA(编码转氢酶a亚基)、pyrC(编码二氢乳清酸)和tnaA(编码色氨酸酶)。将序列信息上传至PubMlst网站进行比对,以确认等位基因和序列型别(Sequence Types, STs);应用eBURST软件对菌株的ST型别进行分析,确定同源复合体等信息；应用Mega 5.1软件比对每个ST型别所对应的7个等位基因的连锁序列构建最小进化(ME)树,分析各菌株间的亲缘关系；同时应用START 2软件分析MLST数据,计算dN/dS率、关联的标准化指数IsA、统计沉默核苷酸位点的数目等,以分析各位点核苷酸多样性和基因重组的情况。结果：1.血清学分型：本研究共收集得到广东省2007-2013年腹泻病例副溶血弧菌分离株469株,分为7种O抗原血清型,16种K抗原血清型以及24种组合血清型。其中优势血清型为03：K6型(330株,70.36%),其次为04：K8型(54株,11.51%)和01：KUT型(28株,5.97%)。在本研究中,K抗原不能分型的菌株有44株,而O抗原不能分型的有2株,还发现了较为特别的O1：K36型菌株,在以往的研究中报道较少。2.毒力基因携带情况：有95.74%(449/469)的副溶血弧菌分离株为tdh+trh-菌株,1.28%(6/469)为tdh-trh+菌株,3株为tdh-trh-菌株,仅2株为tdh+trh+菌株。副溶血弧菌分离株中有64.39%(302/469)携带GS-PCR和/或orf8基因。值得注意的是,有8.61%(26/302)仅携带orf8基因,而有8.61%(26/302)仅携带GS-PCR基因,以上两种菌株均缺失了其中一种标识。3.“大流行菌群”分布情况：根据副溶血弧菌“大流行菌群”的判定标准,共有63.75%(299/469)的菌株被判定为“大流行菌群”,包括7种血清型：03：K6型、04：K8型、O1：KUT型、O1：K38型、03：K29型、04：K68型和05：K68型,其中,03：K6型的分离株最多。4.MLST结果①等位基因型及核苷酸多态性情况：7个管家基因的等位基因数从16(pntA)到20(gyrB)不等。各管家基因的核苷酸多态性位点数在23(dnaE)到161(recA)之间浮动。每个管家基因位点出现频率最高的等位基因分别是：dnaE-3(96株),gyrB-4(101株),recA-19(95株),dtdS-4(95株),pntA-29(94株),pyrC-4(94株)以及tnaA-22(95株)。在dnaE、recA、pntA、pyrC和tnaA四个基因中,dN/dS率(非同义变异与同义变异的比率),均小于1,而在gyrB和dtdS基因中值为0。7个管家基因的平均G+C含量在43.92%(pntA)到50.27%(dtdS)之间浮动,与副溶血弧菌本身的45.4%G+C含量接近。②ST型分布情况：150株副溶血弧菌分离株共被分为30个不同的ST型别,其中有3个ST型为首次发现,之前在数据库中并未出现过,分别为：ST-1117、ST-1118和ST-1119型。21个ST型只有一株分离株,而剩下的7个ST型分别包括了2到89株不等的分离株。而本研究中出现频率最高的ST型为ST-3型(89株,59.33%),主要由03：K6型菌株组成(79株,88.76%)。③同源复合体：通过eBURST软件的分析,30个ST型别被分为：1个同源复合体(Clonal Complex, CC)CC3,3个双联体(Doublets, D)D1、D2和D3,以及19个独特型(Singletons, S)。CC3共包括95株分离株,涵盖5个ST型(ST-3、ST-431、ST-661、ST-435和ST-787),其中ST3型被定义为该同源复合体的始祖序列型(ancestral type or founder)。④集群与系统发育分析：ME进化树(minimum evolution tree)是由30个ST型的7个管家基因的串联序列构建而成。在本研究中,ME树主要包括两个部分,它们之间的遗传关系较远。eBURST与ME进化树的分析结果基本一致,但双联体D1中的ST-189和ST-265由于其在recA位点上的差异,被分成了单独的两部分,还将一些独特型分在了同一簇群中建立了进化关系。与eBURST相比,ME进化树具有更好的分辨力,能够揭示一些eBURST未能发现的群组或独特型之间的进化发育关系。⑤基因重组情况：运用START2软件,对7个管家基因的DNA序列进行分析,发现recA基因的沉默多态位点数目多达126个,显著高于其他管家基因。在对7个管家基因进行连锁平衡的分析时,得到的关联的标准化指数IsA=0.9024(p<0.05),表明7个管基因之间存在显著的连锁不平衡现象。而排除“大流行菌群”分离株后,再次进行计算,得到的关联的标准化指数IsA＝0.8063(p<0.05),较150株的关联的标准化指数有所下降。结论：1.广东省2007-2013年间的腹泻病例副溶血弧菌优势血清型为03：K6型,绝大部分腹泻病例分离株为致病性副溶血弧菌。2.广东省2007-2013年间由副溶血弧菌“大流行菌群”感染所引起的腹泻病例在副溶血弧菌感染中所占的比重超过50%,表明在广东省,“大流行菌群”仍然为优势流行克隆群,因此要加强对“大流行菌群”生长环境及传播途径的研究,以便更好地应对副溶血弧菌所引发的食源性疾病。3.广东省2007-2013年间仅鉴定出1个副溶血弧菌同源复合体,为CC3,其始祖序列型为ST-3。同源复合体CC3包含了大部分被鉴定为“大流行菌群”的分离株,但有少部分归入了其他ST型中。4.广东省副溶血弧菌存在基因重组现象,尤其是在recA基因位点。recA位点频繁发生的基因重组现象,可能使其在MLST分析中不再是一个理想的基因标记物。