小立碗藓属于非维管束植物,与高等植物相比,没有真正的根和叶,只有假根和拟叶,并且没有能够疏导物质的维管系统。木质素主要存在于维管束植物中,是植物抵御外界环境的重要成分之一。肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl-alcohol dehydrogenase,CAD)是木质素合成途径中的关键酶,对合成木质素单体的最后一步反应具有催化作用,将三种肉桂醛还原生成相应的三种肉桂醇。作为非维管束植物小立碗藓是否合成木质素一直存在争议,本实验室前期通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析灰霉菌胁迫下小立碗藓是否生成木质素,结果表明灰霉菌胁迫下小立碗藓可能合成了类木质素。通过转录组高通量测序和实时荧光定量PCR分析小立碗藓在灰霉菌胁迫下类木质素合成途径关键基因的表达情况,结果表明CAD1呈现了差异表达。目前关于CAD在其他植物中的功能研究已有报道,但是关于CAD在小立碗藓受生物胁迫下所行使的功能还未见报道。本研究通过反向遗传学技术进一步研究小立碗藓在灰霉菌胁迫下CAD1的功能,旨在揭示生物胁迫下小立碗藓机体相关基因的应答机制,为登陆早期的陆生植物的抗病机理和进化历程提供了理论依据。该研究的初步成果如下:1、在崩溃酶工作浓度为1%、30 min处理条件下,得到的原生质体活性高且数量多,对原生质体进行再生,再生率达到了90%以上。在PEG工作浓度为20%时,获得了稳定的遗传转化株。通过以上条件的优化,为本实验室建立了一套PEG介导原生质体转化体系,为后续基因功能的研究奠定了基础。2、成功构建了CAD1-PTFH15.3超表达载体和CAD1-GFP-PTN182敲除载体,利用同源重组的原理,用PEG介导的遗传转化方法将载体转化到小立碗藓原生质体中。通过抗性筛选和分子水平上的鉴定,分别获得了敲除载体和超表达载体的转化株。3、用灰霉菌侵染野生型和转化型植株,在荧光显微镜下观察灰霉菌的感染行为和菌丝形成率。结果显示:野生型和敲除转化株菌丝形成率分别达到了65.5%和65.9%,超表达转化株菌丝形成率达到了49.3%。超表达转化株的菌丝形成率低于野生型植株,说明CAD1在灰霉菌胁迫下可能通过合成类木质素参与了防御反应。野生型和敲除型转化株菌丝形成率相近,可能是因为CAD的其它同源基因参与了功能补偿。