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人细小病毒B19(human parvovirus B19)为细小病毒科红病毒属的成员,主要通过呼吸道传播,也可通过输血或血液制品传播,还可以在母婴之间垂直传播。对于免疫功能正常的人群,B19主要引起儿童的传染性红斑和成年人的关节痛或关节病;而对于免疫力低下者,感染B19会引起单纯红细胞再生障碍及慢性贫血;对于孕妇,B19感染严重时可致胎儿水肿,宫内死胎等。由于目前国内没有商业化的B19抗体检测试剂,有必要建立B19血清抗体检测方法。本研究拟利用原核表达系统或真核表达系统表达B19病毒衣壳蛋白VP2,用纯化后的VP2蛋白作为检测抗原,初步建立抗B19血清IgG和IgM抗体检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)法。一、人细小病毒B19衣壳蛋白VP2的制备实验目的:利用原核表达系统和重组腺病毒真核表达系统分别表达并纯化B19病毒衣壳蛋白VP2。方法:分析VP2编码区,利用重叠延伸PCR合成密码子优化的VP2基因,测序验证后,亚克隆到原核表达载体pET30a(+)或pET44a(+),分别将重组质粒转化对应的宿主菌,利用IPTG诱导目的蛋白表达。包涵体蛋白在变性后使用DEAE琼脂糖阴离子交换层析法或固化金属层析法纯化;十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting分析评价纯化效果;将部分纯化蛋白免疫新西兰大白兔,收集抗血清,再利用亲和层析法分离纯化血清IgG。在构建腺病毒表达系统过程中,先构建携带B19 VP2基因的穿梭质粒,与骨架质粒pAdEasy-1在E. coli BJ5183菌株中同源重组产生腺病毒质粒,线性化后转染293细胞,拯救并扩增携带VP2基因的重组腺病毒Ad5-VP2;Ad5-VP2感染293细胞,Western blot检测B19 VP2蛋白的表达情况。结果:重叠延伸PCR结合突变校正方法,最终得到密码子优化的B19 VP2编码区;成功构建了两种原核表达载体,实现了目的蛋白的以包涵体形式高效表达;采用更换表达载体和表达细胞等多种实验方案,未能实现VP2蛋白的可溶性表达;采用变性条件下的阴离子交换层析由包涵体得到纯化的VP2蛋白,多步透析、降低变性剂浓度复性得到部分可溶性蛋白。变性的纯化蛋白免疫动物,得到抗B19VP2的兔IgG,并进行辣根过氧化物酶标记。另外,成功构建了携带B19 VP2基因的重组腺病毒,在其感染的293细胞能够检测到B19 VP2的表达,但其表达量低,不足以形成病毒样颗粒(VLP)或用于蛋白纯化。结论:采用多种实验方案成功表达了VP2,但未能获得B19 VP2形成的VLP;通过包涵体变性-复性最终获得了可溶性VP2,并制备了HRP标记的兔抗B19 VP2 IgG,为建立检测人血清抗B19抗体的ELISA方法打下了基础。二、人细小病毒B19抗体检测方法的建立实验目的:建立人血清细小病毒B19抗体(IgG和IgM)检测的ELISA方法。方法:先以不同浓度人IgG包被ELISA板,确定辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG抗体的适宜稀释度;再以棋盘滴定的方法确定可溶性VP2使用浓度、人血清稀释度以及包被液的种类,建立检测人血清B19 IgG的间接ELISA方法。以可溶性VP2包被ELISA板,确定HRP标记兔抗VP2 IgG的使用稀释度;再以棋盘滴定的方法确定抗人IgM抗体的包被浓度和血清稀释度,建立捕获ELISA方法检测人血清抗B19 IgM抗体。最后利用建立的ELISA方法对355份孕妇和献血员的血清进行了检测,并以德国维润公司的人细小病毒B19 IgG/IgM定量检测试剂盒为对照,分析检测结果。结果:在人血清细小病毒B19 IgG抗体检测的ELISA建立中,确定了包被抗原VP2的浓度为5μg/ml,封闭液的成分为5%NCS的PBS,封闭时间为2h,山羊抗人IgG-HRP的稀释比例为1:10000;在人血清细小病毒B19 IgM抗体检测的ELISA建立中,确定了兔抗人IgM的包被浓度为5μg/ml,封闭液的成分为5%的NCS,抗原VP2的稀释比例为1:100,兔抗人VP2-HRP的稀释比例为1:6000。结论:初步建立了B19病毒人血清IgG或IgM抗体检测的ELISA方法。综上所述,我们合成了细小病毒B19衣壳蛋白VP2的基因编码区,并构建了原核表达载体,纯化制备了可溶性VP2蛋白;初步建立了人血清抗B19 IgG和IgM检测的ELISA方法,并对355份血清进行了实际检测。方法的可靠性还有待进一步评价。