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目的(1)通过建立大鼠原位肝移植动物实验,观察从Lewis大鼠供体到BN大鼠受体肝移植后移植肝脏能否产生急性排斥反应,以及输入肝再生增强因子(Agumenter of liver regeneration, ALR)后,对移植肝脏免疫急性排斥反应(Acute rejection, AR)的影响。(2)观察移植肝脏中Th1淋巴细胞因子IL-2和IFN-γ基因和蛋白质的表达以及肝脏内淋巴细胞的凋亡率和活化率,以了解ALR对肝脏内淋巴细胞的影响。(3)观察移植肝脏中枯否细胞(Kupffer cells, KCs)细胞因子TNF-α和IL-2基因和蛋白质的表达变化,阐明ALR对KCs功能的影响。(4)通过体外分离培养脾脏淋巴细胞和肝脏KCs,观察KCs在ALR抑制脾脏淋巴细胞的增殖活化、凋亡和细胞因子表达的作用,探讨KCs在ALR改善大鼠肝移植后急性排斥反应中的作用机制。通过以上四部分实验,试图阐明ALR在大鼠原位肝移植急性排斥反应中的作用及其确切机制。方法(1)按“二袖套法”建立近交系大鼠原位肝移植动物模型,将大鼠分为3组:①同基因移植组(Isograft group),②同种异基因组(Allograft group),③同种异基因ALR干预组(ALR group)。后者于移植后用ALR 100μg/kg经尾静脉注入受体大鼠体内,以后每日腹腔内注射ALR 100μg/kg至处死受体大鼠。分别于术后3天、5天和7天活杀,收集标本。观察各组受鼠存活率;急性排斥反应组织病理学分级按Banff标准进行,各项评分的总和为最终急性排斥反应评分,即急性排斥反应指数(rejection activity index, RAI);全自动生化分析法测定血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平变化,确定近交系大鼠同种异基因肝移植后急性排斥反应的形成及ALR对移植肝脏急性排斥反应的影响。(2)肝移植7天后分离上述三组动物肝脏淋巴细胞,对分离淋巴细胞用流式细胞仪检测淋巴细胞活化率和凋亡率,用real time-PCR法测定淋巴细胞中IFN和IL-2基因表达,用免疫组化法和Western blot蛋白印迹等方法测定淋巴细胞中IFN和IL-2蛋白质表达;探讨ALR减轻大鼠肝移植后急性排斥反应的机制。(3)按上述方法建立大鼠肝移植动物模型和进行动物分组,于肝移植术后7天活杀动物取其肝脏分离KCs,提取KCs中的总蛋白和总RNA,用免疫组化法测定肝组织中TNF-α和IL-10的基因表达,用Western blot蛋白印迹法和Real time-PCR法测定KCs中TNF-α和IL-10基因和蛋白质的表达,探讨ALR对肝移植后KCs功能的影响,阐明ALR减轻大鼠肝移植后急性排斥反应的机制。(4)分别分离BN大鼠KCs和Lewis大鼠脾脏淋巴细胞。共分为4组:①ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞(A组),②ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞+30μg/ml ALR(B组),③ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞+KCs(C组),④ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞+KCs+30μg/ml ALR(D组)。用流式细胞仪检测各组脾脏淋巴细胞凋亡率和活化率;H3掺入法检测脾脏淋巴细胞增殖;ELISA检测各组IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平。结果(1)三组大鼠原位肝移植主要手术步骤所需时间无明显差异。在未应用任何免疫抑制剂的情况下,Allograft组大鼠原位肝移植后三天后开始出现急性排斥反应,7天时进展迅速。术后3天,三组大鼠RAI评分和肝功能没有明显差异(P>0.05)。术后5天各组RAI评分分别为:Allograft组(6.33±1.03), Isograft组(1.50±0.55)和ALR组(2.83±0.75);ALR组和Isograft组急性排斥反应,肝功能损害较Allograft组明显减轻(P<0.05)。术后7天RAI评分分别为:Allograft组(8.17±0.75),Isograft组(1.33±0.52)和ALR组(2.83±0.75);Allograft组急性排斥反应进一步加重,肝功能进一步恶化,而ALR组和Isograft组变化不明显(P>0.05)。三组平均生存时间分别为:Allograft组(11.17±1.47d), Isograft组(49.67±17.31d)和ALR组(46.17±10.22d);ALR组受体大鼠的平均生存时间较Allograft组明显延长(P<0.05)。(2)肝移植组术后7天,肝移植组中免疫组织化学显示:Allograft组IL-2和IFN-γ在肝脏组织中较Isograft组表达明显增高,主要集中于汇管区的淋巴细胞和枯否细胞胞浆中;而在ALR组,这种增高的表达被明显减弱。Realtime-PCR检测分离的肝脏淋巴细胞中IL-2和IFN-γ基因转录,Allograft组分别为:8.53±0.75和9.32±0.83,较Isograft组(1.96±0.24和1.29±0.19)明显增加(P<0.05); ALR组分别为:2.19±0.19和1.48±0.21,同种异基因肝移植后应用ALR能够明显减弱淋巴细胞中IL-2和IFN-γ基因转录,与Allograft组比较有显著性差异(P<0.05),但与Isograft组比较无显著性差异(P>0.05)。Western blot蛋白印迹法测定IL-2和IFN-γ基因表达三组分别为:Isograft组(0.0079±0.0006和0671±0.011),ALR组(0.0102±0.0005和0.0954±0.0006)和Allograft组(0.0917±0.001和0.1963±0.0007);显示出相同的趋势。肝移植后分离的受体大鼠肝脏淋巴细胞IL-2R阳性率:Allograft组为较Isograft组明显增高分别为0.25±0.07和0.07±0.03(P<0.05);而ALR组肝脏中淋巴细胞IL-2R阳性率为0.08±0.03,与Allograft组比较明显减低(P<0.05);与Isograft组比较,无显著性差异(P>0.05)。凋亡率Allograft组为0.16±0.04,较Isograft组(0.49±0.05)和ALR组(0.45±0.06)凋亡率明显下降(P<0.05)。(3)肝移植组术后7天,肝脏组织免疫组织化学结果显示:Allograft组中肝脏组织TNF-α的表达较Isograft组明显增强,ALR能够明显抑制TNF-α的表达增强;Allograft组较Isograft组IL-10蛋白表达明显减弱,ALR能够增强IL-10的表达。Realtime-PCR测定分离的KCs中TNF-α的基因转录为8.69±0.63,较Isograft组(3.43±0.34)和ALR组(3.86±0.42)明显增高(P<0.05),ALR明显降低了同种异基因肝移植KCs中TNF-α的基因转录。Allograft组KCs中IL-10的基因转录为1.24±0.18,较Isograft组(4.58±0.57)和ALR组(5.76±0.32)明显增高(P<0.05);ALR明显增强了同种异基因肝移植KCs中IL-10的基因转录。Western blot蛋白印迹法测定TNF-α和IL-10基因表达三组分别为:Isograft组(0.2131±0.0049和0.0404±0.0013)、ALR组(0.2586±0.0059和0.0644±0.001)和Allograft组(0.5336±0.0013和0.0157±0.0006);显示出相同的趋势。(4)在ConA的刺激下B组脾脏淋巴细胞增殖和IL-2R阳性率(2.0083±0.245×10~6cpm和0.2817±0.0392)较A组(3.9817±0.2101×10~6cpm和0.465±0.0568)明显减少(P<0.05),但是明显高于C组(1.545±0.2239×10~6cpm和0.2983±0.0319)和D组(0.64±0.1401×10~6cpm和0.0783±0.0271)(P<0.05); C、D两组中,C组淋巴细胞增殖、IL-2R阳性率明显高于D组(P<0.05)。凋亡率检测发现,B组(0.0622±0.0148)与A组(0.0457±0.008)脾脏淋巴细胞凋亡率没有明显差异(P>0.05),但是C组(0.1617±0.0263)脾脏淋巴细胞凋亡率较A和B组明显增加(P<0.05),应用ALR的D组(0.2775±0.0199)中脾脏淋巴细胞凋亡率较C组明显增加(P<0.05)。ELISA检测各组培养上清液中的细胞因子发现,B组上清液中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量(609±30.45 pg/ml、466.57±20.98 pg/ml和444.35±33.65 pg/ml)较A组(1455.83±101.35 pg/ml、894.05±23.17 pg/ml和931.48±43.34 pg/ml)显著下降(P<0.05), B组IL-10含量(155.57±16.06 pg/ml)较A组(96.65±23.18 pg/ml)升高(P<0.05)。C组中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量(695.35±30.23 pg/ml、490.77±21.5 pg/ml和410.42±21.22 pg/ml)较A组减少(P<0.05),但是IL-10含量(253.93±27.98 pg/ml)明显增加(P<0.05)。在同时加入KCs和ALR共培养的D组中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量分别为(240.9±16.36 pg/ml、229.4±26.89 pg/ml和124.17±22.82 pg/ml)较C组明显减少(P<0.05),IL-10的含量为578.8±20.55 pg/ml,较C组明显增加(P<0.05)。四组中D组中IL-2、IFN-γ及TNF-α含量最低,IL-10含量最高;而A组则相反。结论(1)在未应用任何免疫抑制剂的情况下,从Lewis大鼠供体到BN大鼠受体之间的同种异基因原位肝移植术后7天产生明显的急性排斥反应,首次证实ALR能够明显减轻同种异基因原位肝移植术后急性排斥反应,改善肝功能,降低死亡率,延长生存时间。(2)首次证实ALR减轻同种异基因原位肝移植后急性排斥反应与ALR降低肝脏内IL-2和IFN-γ表达,进而抑制肝脏内Th1淋巴细胞活化促进凋亡有关。(3)首次证实ALR可能通过调节肝移植后移植肝脏内KCs细胞因子的表达抑制抑制肝脏内Th1淋巴细胞的功能,进而抑制急性排斥反应。(4)首次发现ALR可以直接作用于淋巴细胞,抑制淋巴细胞增殖活化,但是不能直接促进其凋亡。(5)首次证实ALR促进淋巴细胞凋亡与ALR调节KCs中细胞因子的表达,使KCs中TNF-α基因和蛋白质的表达减弱,增强抑制性细胞因子IL-10的基因和蛋白表达,促进KCs对浸入移植肝内T淋巴细胞的杀伤作用有关。