1研究目的我国是胃癌高发国家,占消化道肿瘤的第一位,直至目前手术切除仍是唯一可以治愈的手段,每年约有40万例病人接受胃切除手术。手术对器官和组织的广泛切除(以达到根治目的)及其切除后的消化道重建,导致营养不良和免疫功能下降,常伴随术后并发症增加和肿瘤复发提早,严重者可引发肠黏膜屏障功能障碍和细菌移位,导致更为严重的并发症发生。现代外科对之尚无甚好办法。我们通过多年的临床研究,确立了胃癌术后(早期)理法方药原则,总结和凝练出:胃切除手术后,病人不仅有脾虚表现,而且还有腑实证候。根据中医辨证虚实夹杂证,治疗上健脾泻下之芪黄煎剂口服。为开展本研究搭建了坚实的中医实践和理论平台。建立了术后早期胃癌手术的小肠滴注途径和方法,胃癌手术后早期肠内营养管的内部结构,专利号:ZL201620247116.X。20多年的临床观察表明,健脾通里中药对胃肠动力的恢复,营养状况和免疫功能的改善,以及术后并发症的防治有很好的效果。并通过主持2项国家自然基金,明确了其对肠黏膜上皮细胞和免疫细胞结构及其功能的影响;但对胃切除后ICC(interstitial cells of Cajal)细胞的网络结构及其数量(分泌神经递质及相应受体)的研究尚未进行。ICC主要分布于胃肠道(也分布在其他脏器),激光共聚焦显微镜观察到,胃肠道ICC分布广泛,包括肠肌间神经丛,深部肌丛,粘膜下层,浆膜下等。目前公认分布于胃肠道ICC主要有2种功能:(1)胃肠起搏功能,具有产生和传导胃肠自主节律电活动和控制胃肠平滑肌收缩的功能。(2)信号转导功能,通过介导神经介质及其信号传递将神经冲动传递给胃肠平滑肌细胞。可以说ICC细胞的数量和结构是维持胃肠道正常运动的关键。因此,从ICC细胞结构及其信号通路出发,探讨中医药促进胃切除术后胃肠动力恢复的机制是关键。本研究旨在观察芪黄煎剂(QiHuang Decoction,QH)对胃癌术后胃肠功能恢复的影响及其基于ICC细胞机制的探讨。并通过动物实验,进一步探讨芪黄煎剂对胃肠功能恢复的作用机制;通过手术创伤建立Wistar大鼠胃切除动物模型,随后滴注中药芪黄煎剂于小肠内进行干预,观察QH对大鼠胃切除后胃肠功能的影响。讨论QH对胃肠功能恢复的作用机制。2研究方法2.1临床观察2.1.1资料来源和分组选择2016年1月—2018年12月安徽省中医药大学第一附属医院普外科收治的确诊为胃癌患者的128例病例资料。分为对照组和观察组,采用随机数字表(SPSS10.0生成)结合信封法按1:1平行随机。2.1.2治疗方法对照组:(1)入院后常规手术准备,根治性胃切除术;(2)手术前,将直径3毫米,长1米的硅胶管放入距离胃管前端5毫米的侧孔中,固定导线以防脱落,然后放入胃内。(3)将患者置于仰卧位,插管进行全身麻醉。在上腹正中部位做切口,绕开脐部,进行常规腹腔探查,结扎胃供血血管,游离并切除大网膜,清扫淋巴,保证充分暴露贲门。切断迷走神经,常规食管空肠吻合术。在手术过程中,通过吻合将硅胶管和胃管拉出,将两个管分开,将胃管置于胃腔中。将硅胶管置于远离吻合口30-40cm的远端小肠中。术后给予5-FU和腹腔引流管,逐层缝合切口后进行常规支持治疗,如补液,抗感染和保肝等。从手术后第一天开始,通过硅胶管滴注150mL生理盐水。观察组:手术后第一天,用芪黄煎剂小肠内滴注(黄芪20g,大黄10g(后下),白术20g,党参20g,枳实10g,厚朴10g,丹参15g,黄芩12g),每天2次,每次150mL中药煎液,温度37~38℃,速度30~40mL/min。2.1.3观察指标及其方法机体功能恢复情况:记录每组患者肠鸣音恢复时间,首次排气时间,首次排便时间,由专人询问并记录。并发症的观察:并发症包括尿路感染,腹腔感染,腹腔内出血,吻合口瘘和肺部疾病等。2.1.4统计学方法使用统计软件SPSS23.0分析数据,计量资料以((?)±s)表示,计数资料以例数或百分比形式呈现。检查两组资料的正态性,方差齐,两组间数据比较采用两独立样本t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。2.2动物实验2.2.1造模和分组方法(1)造模方法:选健康清洁的Wistar大鼠(4个月,雄性),建立大鼠胃切除手术模型。1%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉,用碘伏和酒精消毒手术视野,选择腹部正中切口进腹,逐层进入腹腔,找到大鼠的胃,将位于胃体部大小弯之间的胃前壁部分切除,先用1-0丝线间断全层缝合,在浆肌层再缝合一层加固。缝合完成后,找到大鼠十二指肠悬韧带(Treitz韧带),在其远端15cm处的空肠前壁,用12号注射器针头戳一小孔,将直径1.0mm硅胶导管置入空肠内,作双层荷包缝合将硅胶管固定,在腹壁上另戳一小孔,将导管另一端经小孔引出腹部皮下,在大鼠颈背部双侧肩甲区与腹壁小孔之间建立一个皮下隧道。将导管从由颈背部双侧肩胛区皮肤引出固定,最后将腹部和颈背部切口逐层缝合。(2)分组方法:采用随机对照分组,60只大鼠由软件制作随机码随机分为4组,每组15例:(1)对照组;(2)假手术组;(3)标准肠内营养组;(4)标准肠内营养+芪黄煎剂组。2.2.2各组干预方法对照组:不作任何干预,自由进食饮水,不给肠内营养制剂和中药芪黄煎剂。假手术组:仅给予腹部正中切开后缝合,未进行胃切除术。不给肠内营养制剂和中药芪黄煎剂。标准肠内营养组:进行胃切除术并给予标准的肠内营养。EN+QH组:再给予5g/(kg.d)的芪黄煎剂。2.2.3观察指标方法(1)胃肠电生理活动检测检测方法:治疗结束后,将各组大鼠禁食24小时,并用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉,用碘伏和酒精消毒手术视野,选择原腹部正中切口进腹,逐层进入腹腔,于幽门后3-5cm之间用铂金丝电极插入小肠肌层,参考电极夹于皮下,电极输入端连接BL-420生物功能实验系统(成都泰盟科技有限公司)。调节参数为:生物电模式,200μV,1.0s/div,30Hz。波形稳定后,开始记录波形20分钟并保存波形,应用RM6240B/C多道生物信号采集与处理系统软件分析振幅,频率和频率变化系数。(2)大鼠小肠推进率的检测检测方法:胃肠电生理活动检测完毕后,给予每只大鼠0.2ml碳墨,经营养管注入,30min后经1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(2mL/kg)处死,立即进行剖腹手术,将幽门切开至回盲肠,并测量从幽门括约肌到色素前端到盲肠根部的距离,参照文献方法,计算小肠推进百分率:肠推进率=肠内推进剂距离/小肠全长×100%。(3)ICC细胞数目及结构检测方法:新鲜组织决定材料的位置,最大限度地减少拉动,挫伤和挤压等机械损伤,组织体积一般不超过1mm×1mm×1mm。将固定在4℃的电子显微镜固定溶液快速放入2-4小时。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次,每次15min。经过固定、脱水、包埋、切片、染色。在透射电子显微镜下观察,获得图像分析。(4)SCF和C-kit蛋白表达检测方法:造模2月后,ELISA测定SCF和C-kit蛋白表达,切割标本,收集上清液,加入酶标试剂,温育,配液,洗涤,显色,测定450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。计算SCF和C-kit的OD值。乘以稀释倍数,即为SCF和C-kit的浓度。2.2.4统计学方法所有计量数据资料用均数±标准差(`x±s)表示,两组以上资料对比采用单因素(AVOVA)方差分析,采用SPSS 23.0软件进行处理,P<0.05认为有统计学差异。3研究结果3.1临床观察结果观察组肠鸣音恢复时间(46.75±8.69h),对照组肠鸣音恢复时间(53.05±10.63h),与对照组相比观察组能促进患者肠鸣音的恢复(P=0.034);观察组首次排气时间(50.28±7.02h),对照组首次排气时间(60.48±10.32h),与对照组相比观察组能促进患者排气(P=0.025);观察组首次排便时间(55.75±9.82h),对照组首次排便时间(65.05±10.13h),与对照组相比观察组能促进患者排便(P=0.046);对照组和观察组两组并发症的发生率无明显差异(P>0.05)。3.2动物实验结果通过生物机能实验系统观察胃切除大鼠小肠蠕动的节律性,发现芪黄煎剂能明显改变大鼠小肠的电生理运动;通过碳墨测小肠推进率,正常组大鼠小肠推进率为66.2±3.8%;假手术组小肠推进率为63.5±4.6%;标准营养组小肠推进率为32.5±4.0%;标准营养+中药组小肠推进率为40.5±3.7%;与标准营养组相比标准营养+中药组小肠推进率显著提高(P=0.034);这些结果显示芪黄煎剂能够显著改善胃切除后大鼠小肠推进能力。与正常组相比,标准营养+中药组小肠推进率显著降低(P=0.002);与假手术组相比,标准营养+中药组小肠推进率显著降低(P=0.003)。通过透射电镜观察,标准营养+中药组相比于营养组能改变ICC细胞的形态结构。通过ELISA测定SCF和C-kit蛋白的表达,正常组大鼠小肠SCF蛋白浓度为2011.00±169.88pg/ml,假手术组SCF蛋白浓度为1742.83±183.71pg/ml,标准营养组SCF蛋白浓度为1206.33±129.83pg/ml,标准营养组+中药组SCF蛋白浓度为1436.58±206.74pg/ml,与标准营养组相比,标准营养组+中药组能显著提高SCF浓度(P=0.014);与正常组相比,标准营养组+中药组的SCF浓度显著下降(P<0.001);与假手术组相比,标准营养组+中药组的SCF浓度显著下降(P=0.001);正常组大鼠小肠C-kit蛋白浓度为2045.97±169.87pg/ml,假手术组C-kit浓度为1701.25±88.62pg/ml,标准营养组C-kit蛋白浓度为1330.41±127.23pg/ml,标准营养组+中药组C-kit浓度为1561.66±205.69pg/ml,与标准营养组相比,标准营养组+中药组能显著提高C-kit浓度(P=0.001);与正常组相比,标准营养组+中药组的C-kit浓度显著下降(P<0.001);与假手术组相比,标准营养组+中药组的C-kit浓度显著下降(P=0.032);通过IHC检测C-kit阳性面积,正常组大鼠小肠C-kit阳性面积为182.04±10.15,假手术组C-kit阳性面积为166.06±14.19,标准营养组C-kit阳性面积为119.37±17.21pg/ml,标准营养组+中药组C-kit阳性面积为143.49±16.83,与营养组相比,标准营养组+中药组能显著提高C-kit阳性面积(P=0.001);与正常组相比,标准营养组+中药组C-kit阳性面积下降(P<0.001);与假手术组相比,标准营养组+中药组C-kit阳性面积下降(P<0.001)。4研究结论(1)临床观察和动物实验均表明,胃切除术后应用中药芪黄煎剂,能促进患者胃肠运动功能的恢复。(2)芪黄煎剂促进胃肠运动功能的恢复,可能与增加SCF和C-kit表达、恢复ICC细胞数目有关。