研究背景：间充质干细胞(MSCs)因其来源广泛,并具有多向分化能力和免疫调节功能成为最具临床应用前景的成体干细胞。深入了解MSCs的表面标志对于MSCs的分离、纯化、鉴定、功能研究以及最终在临床治疗应用中细胞类型的选择都具有重要的理论和现实意义。虽然CD73、CD90、CD105等标志成为MSCs公认的标准,但这些标志并不能反映MSCs自我更新、多向分化以及对微环境敏感性等“干性”特点。前期研究中,我们发现粘附分子CD49f (integrin α6)在胎儿和成人骨髓来源的MSCs (BMSCs)中呈差异性表达。粘附分子做为一类重要的细胞膜表面蛋白,其介导的干细胞与其微环境中支持细胞或ECM之间的相互作用是干细胞保持其干性的关键。CD49f不仅是一个干性相关基因,可作为多种干细胞的表面标志,如胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞等,而且通过与微环镜中ECM成分laminin的结合在干细胞自我更新与干性维持中发挥重要作用。目前,CD49f在MSCs中的相关研究还很少,胎儿来源BMSCs中CD49f+细胞的富集是否是一类MSCs前体细胞以及CD49f能否做为BMSCs的干性标志等有待阐明；同时,作为微环境中重要组成部分,炎症因子可通过对粘附分子的调节将微环境中生理或病理性信号传导至干细胞,CD49f是否在BMSCs感知微环境中炎症信号并调整自身生物学特性以满足机体需求的过程中发挥作用等问题还需进一步研究。研究目的：1. 检测BMSCs中CD49f+和CD49f-细胞群体在自我更新和多向分化能力方面的差异,明确CD49f是否可作为BMSCs的干性表面标志。2.明确炎症因子对CD49f的调控以及CD49f在BMSCs感知周围环境中炎症信号并调整其生物学特性过程中的作用。3.深入探讨TNF-α调控BMSCs中CD49f表达的机制。研究方法和结果：1.CD49f与骨髓间充质干细胞的干性方法：分别应用流式细胞术和Real-Time PCR的方法检测CD49f在不同来源和不同分化能力的干细胞/细胞中的表达；通过连续传代的方式观察CD49f的动态变化过程以及对环境的敏感性；应用流式细胞仪分选CD49f+及CD49f-BMSCs细胞群体,通过克隆形成实验及成骨、成脂分化诱导对比二者自我更新和多向分化能力的差异。结果：胎儿BMSCs及皮肤成纤维细胞中CD49+细胞比例及mRNA表达水平远高于成人相应细胞,而人胚胎干细胞(hESCs)及羊膜上皮细胞基本全部表达CD49f,且mRNA表达水平也较高；体外培养的胎儿BMSCs在形态学以及国际细胞治疗协会定义的表面标志表达水平同成人BMSCs一致；随着体外传代的增加,CD49f+细胞比例呈下降趋势,且这种下降是由于CD49f本身降低所至；CD49f+细胞亚群的克隆形成和分化能力均强于CD49f-细胞。2.CD49f与炎症因子对BMSCs生物学特性的影响方法：以BMSCs体外培养过程中加入不同种类和浓度的炎症因子进行刺激为模型,利用流式细胞术、Real-Time PCR和Western Blot的方法检测CD49f的改变情况；检测炎症因子对BMSCs分化能力的影响,通过将CD49f敲减和过表达验证其在BMSCs分化能力维持中的作用；采用细胞粘附实验检测BMSCs对CD49f配体laminin的粘附能力及炎症因子对其的影响,通过功能性封闭性抗体验证CD49f在其中发挥的作用；应用免疫共沉淀筛选CD49f结合蛋白,并探讨其与BMSCs炎症环境下粘附和迁移等行为的关系。结果：TNF-α处理BMSCs后可导致CD106的上调和CD49f的下调,其中CD49f异构体A的下降作用明显,而异构体B则无显著改变；而TGF-β1则可下调CD106的表达,对CD49f无明显影响；TNF-α降低BMSCs的成骨成脂分化能力,CD49f特别是异构体A的过表达可促进BMSCs的分化能力,CD49f敲减后其分化能力相应减弱；CD49f介导BMSCs与laminin的粘附,TNF-α诱导的CD49f下降可使BMSCs与laminin的粘附能力减弱；TNF-α诱导BMSCs迁移能力增加,TG2可与CD49f特异性结合,且TNF-α处理后TG2表达升高。3. TNF-α调控CD49f表达的机制方法：加入TNF-α刺激BMSCs后在不同时间点收集细胞,应用western blot、免疫荧光及免疫细胞化学的方法检测NF-κB和mTOR信号通路中各级分子的活化情况；分别应用NF-κB特异性抑制剂SN50及mTOR抑制剂rapamycin和PP242预处理BMSCs后再进行TNF-α刺激,通过检测关键分子的活化情况判断相应信号通路是否被特异性抑制；同时,应用流式细胞术检测上述抑制剂预处理的BMSCs经TNF-α刺激后以及正常培养传代过程中CD49f的改变情况,以判断何种信号通路在CD49f的调控中发挥关键作用。结果：TNF-α处理后BMSCs中NF-κB和mTOR信号转导通路均被活化；SN50可特异性抑制TNF-α诱导的NF-κB p65的核移位,rapamycin和PP242可特异性抑制mTOR及其下游效应分子S6K1及AKT的活化；rapamycin和PP242预处理的BMSCs中TNF-α诱导的CD49f下降明显减弱,而SN50则无此作用；此外,rapamycin和PP242还可抑制体外传代过程中CD49f的下降。研究结论：1.CD49f在胎儿时期BMSCs中的表达远多于成人BMSCs; CD49f对环境变化敏感,体外培养使其呈下降趋势；以CD49f为表面标志分选的CD49f+BMSCs克隆形成及分化能力强于CD49f-细胞,CD49f可做为BMSCs的干性标志。2. TNF-α以浓度依赖性的方式使BMSCs中CD49f下降,CD49f的下降与炎症环境下BMSCs分化能力的减弱密切相关；CD49f介导BMSCs粘附于laminin,CD49f可与TG2特异性结合；TNF-α处理的BMSCs与laminin粘附能力减弱,而跨膜迁移能力的增加,这种变化与CD49f的下降和TG2的升高密切相关。3. TNF-α可引起BMSCs中NF-κB和mTOR信号转导通路的活化,相应信号通路的抑制剂对TNF-α诱导的BMSCs中NF-κB和mTOR信号通路的活化具有抑制作用；但是仅有mTOR信号通路抑制剂rapamycin口PP242可抑制TNF-α诱导的CD49f下降,说明mTOR在CD49f的调控中具有重要作用。4.CD49f作为BMSCs干性表面标志的确立为临床疾病治疗中MSCs的选择提供了一种新的分选标志；CD49f在炎症因子所致BMSCs生物学特性改变过程中的重要作用对于阐明炎症对干细胞的影响具有重要意义；此外,鉴于mTOR在CD49f调控中的重要性,mTOR抑制剂的应用可能为体内炎症环境下BMSCs的保护以及体外培养过程中BMSCs干性的维持建立一种有效的干预手段。