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【背景】非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)属于代谢性疾病,发病率高且逐年增加。该病发病机制复杂,与肝脂肪变性、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应等密切相关。近年研究表明持续的内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ERS)是NAFLD发生发展的主要诱因,而内质网(endoplasmic reticulum,ER)中钙稳态的破坏是导致持续性内质网应激反应的关键。肌浆/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA)是内质网钙再摄取的关键通道。NAFLD病理条件下,SERCA活性抑制导致的钙离子再摄取障碍可引起内质网钙紊乱,诱发内质网应激的持续发生,进而促使NAFLD持续恶化。从传统中医药中提取的有效成分或单体已运用于临床多种疾病的治疗,其有效性显著且毒性较低。苦参碱(Matrine,Mat)是苦参的主要活性成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等多种药理作用。研究发现苦参碱可降低四氯化碳诱导的肝脏脂肪性病变及肝炎大鼠模型血清转氨酶水平;课题组前期研究显示苦参提取物可有效改善NAFLD小鼠肝脏脂肪性病变且对肝细胞钙离子具有一定调控作用;同时,现有的文献报道中苦参碱既可以抑制内质网应激改善纤维化及葡萄糖紊乱,也可以诱导内质网应激发挥抗癌作用,其在内质网应激中的双向调节作用尚有争议。因此,苦参碱对NAFLD/非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的保护作用及在该疾病中对内质网应激的影响与分子机制尚需探讨。【目的】1.通过不同动物模型实验,明确苦参碱对NAFLD及NASH的保护作用;2.通过细胞模型实验,进一步明确苦参碱对肝细胞内质网应激的调控作用;3.通过钙离子调控及分子对接实验,初步阐明苦参碱调控内质网应激的作用机制。【方法】1.将100只C57BL/6J小鼠随机均为10组。其中高脂饮食诱导的NAFLD模型5组(普通饲料组(Con组)、高脂饲料组(HFD组)、苦参碱低剂量干预组(HFD+Mat L组)、苦参碱中剂量干预组(HFD+Mat M组)、苦参碱高剂量干预组(HFD+Mat H组)),苦参碱干预于造模第5周开始,持续8周;蛋氨酸缺乏饮食诱导的NASH模型5组(普通饲料组(Con组)、蛋氨酸缺乏饲料组(MCD组)、苦参碱低剂量干预组(MCD+Mat L组)、苦参碱中剂量干预组(MCD+Mat M组)、苦参碱高剂量干预组(MCD+Mat H组)),苦参碱干预于造模第3周开始,持续4周。小鼠称重后处死,收集小鼠血液检测血清中甘油三酯(serum triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)水平,小鼠肝组织分别进行H&E、油红O染色及相关蛋白含量测定。2.采用L02人肝细胞,以软脂酸(palmitic acid,PA)为造模试剂,将细胞分为正常对照组(Con组)、软脂酸模型组(PA组)及软脂酸+低、中、高剂量苦参碱干预组(PA+Mat L组、PA+Mat M组、PA+Mat H组),分别进行油红O染色检测细胞内脂滴堆积、活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光检测细胞氧化应激状态、线粒体JC-1荧光检测细胞线粒体膜电位变化、免疫组化检测细胞内质网应激状态、Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡变化及免疫印迹实验检测细胞脂代谢、凋亡及内质网应激相关蛋白表达的变化。3.将L02细胞分为Con组、PA组、PA+Mat L组、PA+Mat M组、PA+Mat H组和不同剂量苦参碱组(Mat L组、Mat M组、Mat H组),培养12 h后使用Fura-3/AM钙离子荧光检测试剂及荧光酶标仪检测长时孵育时细胞内钙离子水平变化,同时对正常L02细胞使用苦参碱及钙通道抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)和2-氨基乙氧基二苯硼酸酯(2-Aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)进行瞬时刺激实验探索苦参碱对肝细胞钙平衡的影响,并进行计算机模拟分子对接验证苦参碱与SERCA之间的相互作用关系。最后通过检测SERCA活性验证苦参碱对SERCA的调控作用。【结果】1.(1)在高脂饲料诱导的NAFLD小鼠中,苦参碱可有效改善小鼠肝脏脂肪性病变,降低小鼠体重和血清TC、TG水平,抑制肝脏脂质合成相关蛋白表达;(2)在蛋氨酸缺乏饲料诱导的NASH小鼠中,苦参碱可有效改善小鼠肝脏脂肪性病变及炎性病变,降低小鼠血清ALT、AST水平及促炎因子水平,抑制内质网应激相关蛋白的表达。2.在软脂酸诱导的肝L02细胞中,低、中剂量苦参碱可明显降低肝细胞脂质堆积及脂质合成相关蛋白的表达,减少模型肝细胞内ROS水平,缓解模型肝细胞线粒体损伤,抑制软脂酸导致的肝L02细胞内质网应激反应及凋亡的发生,而高剂量苦参碱的作用无统计学意义。3.(1)在钙离子长时孵育实验中,苦参碱低、中剂量均可抑制软脂酸导致的L02肝细胞胞浆钙离子升高,在瞬时刺激实验中,苦参碱可浓度依赖性升高L02肝细胞胞浆钙离子;(2)苦参碱可部分抑制SERCA经典抑制剂(毒胡萝卜素)对胞浆钙离子的升高作用,分子对接及活性实验证明苦参碱对SERCA有抑制作用。病理条件下,低、中剂量苦参碱可发挥竞争性抑制作用,间接恢复软脂酸降低的SERCA活性,改善内质网钙平衡,抑制内质网应激反应;但高剂量苦参碱主要发挥抑制SERCA活性的作用,对内质网应激的调控作用无统计学意义。【结论】1.苦参碱具有改善NAFLD/NASH小鼠抑制肝脏脂肪病变、炎性反应及内质网应激反应的作用。2.苦参碱可通过竞争性抑制SERCA恢复钙平衡从而改善内质网应激反应,在非酒精性脂肪肝中发挥保护作用。3.本课题初步阐明了苦参碱改善非酒精性脂肪肝的药效和作用机制,为诠释苦参碱调控内质网应激反应机制提供了新的角度,并为拓展苦参碱的临床应用奠定了理论基础。