第一章空卵泡综合征致病突变的定位研究研究目的:空卵泡综合征(EFS)是指在促排卵周期或自然周期中,超声监测下卵泡大小、数目及血清雌激素水平均在正常范围,但经反复抽吸、冲洗均无法获得卵母细胞。目前临床上对于反复发生EFS的患者尚无有效助孕方法,为获得妊娠,这部分不孕女性只能借助于供卵。关于EFS的发病机制至今尚未明确,有研究者认为与卵泡提早闭锁、卵巢老化等因素有关。对于EFS的遗传学发病机制,既往研究包括LHCGR基因突变和2号染色体倒位,但均为单个病人或单个小家系的研究,缺少令人信服的大家系研究。我们前期收集了一个有六个不孕症患者的大家系(家系Ⅰ),先证者及其姐姐的各三个体外助孕周期获得的卵冠丘复合物几乎全部为空黏液团,仅极少数存在退变的卵母细胞,表现为EFS;先证者的两个姑姑与两个堂姐妹也同样为不明原因不孕症患者。本章研究拟通过此大家系,定位EFS的致病突变。研究方法:为明确EFS的致病基因,我们首先对家系Ⅰ进行全基因组连锁分析,找到连锁不平衡区域。该家系为常染色体显性遗传,致病突变由父亲传递。为进一步明确致病突变,我们选择家系Ⅰ中的三个患者、两个突变携带者和两个正常女性对照进行全外显子组测序。对全外显子组测序数据进行生物信息分析并对候选位点进行验证、常用数据库过滤和正常生育女性对照过滤。将最终筛选出的位点在另一个EFS大家系(家系Ⅱ)和EFS散发病人中验证,并追溯携带此突变的散发病人的家族史,明确变异的来源。最后综合上述结果,得到导致EFS的致病突变位点。结果:经全基因组连锁分析发现该家系的连锁不平衡区域位于7p12.3-q21.13。全外显子组测序结果经过生物信息分析及验证、常用数据库和正常生育女性对照中过滤后,得到候选位点:ZP3 c.400G>A(p.Ala134Thr)杂合错义突变。该突变位于家系Ⅰ的连锁不平衡区域中,与疾病状态共分离。在家系Ⅱ中,该突变亦与疾病状态共分离。经连锁分析证实,在这两个大家系中,此突变为独立发生,不存在同源性。在21例EFS散发病例中,有2例携带同一位点相同的突变,追溯家族史发现其中一位患者的突变为新发突变(de novo)。结论:本研究是EFS的首个大家系研究,通过两个EFS大家系和EFS散发病例研究发现ZP3 c.400 G>A(p.Ala134Thr)杂合错义突变可能为EFS的致病突变。本研究也为EFS提供了潜在的诊断靶点:对于取卵呈现空黏液团无法获卵的不孕症患者可早期进行ZP3c.400 G>A的突变筛查,若患者携带此突变,则应避免反复促排卵尝试,尽早转换助孕策略,从而减轻患者的经济负担和精神压力,获得更好的助孕结局。第二章致病突变的体外功能研究研究目的:ZP3基因编码的ZP3糖蛋白是卵母细胞透明带的重要组分。透明带是包绕卵母细胞的结构,是卵母细胞的“外衣”,在卵母细胞发育、受精及早期胚胎发育过程中起到重要的作用。p.Ala134Thr突变位于ZP3的ZP功能域,ZP功能域在透明带组装过程中发挥重要的作用。本章将通过体外实验对p.Alal34Thr进行功能研究。研究方法:首先通过卵母细胞免疫荧光染色和卵巢活检组织石蜡切片染色等方法,对空卵泡综合征患者卵母细胞的具体异常进行表征。用PyMol软件预测突变对ZP3糖蛋白分子三维结构的影响。随后通过构建野生型、突变型表达载体,并转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中,裂解细胞获得总蛋白,利用免疫共沉淀技术探究突变型蛋白对蛋白互作的影响。结果:家系Ⅰ先证者穿刺取卵获得的绝大多数为空黏液团,极少数包含无透明带的退变卵母细胞。免疫荧光显示卵母细胞核物质完全崩解,且卵外周无ZP3信号聚集。卵巢活检石蜡切片示卵泡中的卵母细胞无透明带结构且呈退变状态。免疫共沉淀实验证实野生型ZP3可与ZP2结合,突变型ZP3不与ZP2结合,但野生型、突变型ZP3同时存在时,突变型ZP3通过与野生型ZP3结合以阻止野生型ZP3与ZP2的结合,发挥显性负效应的作用,妨碍透明带的形成。结论:p.Ala134Thr突变发挥显性负效应的作用,抑制ZP3与ZP2的结合,妨碍透明带的形成,引起卵母细胞退变,表现为空卵泡综合征。第三章致病突变的小鼠模型研究研究目的:透明带的结构在哺乳动物中具有很高的保守性。小鼠透明带由Zp1、Zp2、Zp3基因编码的糖蛋白构成,由Zp2和Zp3相互连接成纤维状结构,Zp1连接这些纤维构成三维网状结构。在既往的报道中,Zp3基因敲除小鼠完全不孕,超数排卵实验获得的卵冠丘复合物大多为空黏液团,少数取到的卵母细胞无透明带,这与本研究中空卵泡综合征患者的表型极为相似。人和小鼠的ZP3均包含424个氨基酸,氨基酸序列同源性达67%。除外小鼠、大鼠等啮齿类动物,ZP3糖蛋白的第134位氨基酸位点在各物种中均为丙氨酸(Ala)。小鼠Zp3糖蛋白在此位点为性质与丙氨酸类似的缬氨酸(Val)。因此,在构建点突变小鼠模型时,我们将小鼠Zp3基因一条链突变为苏氨酸(Thr),另一条链保持不变,仍为缬氨酸,即获得p.Val 134Thr小鼠。本章将对p.Val 134Thr点突变小鼠进行研究,进一步验证该突变的功能。研究方法:利用CRISPR-Cas9编辑的“类精子细胞”单倍体细胞系制备p.Val134Thr点突变小鼠,与性成熟的野生型雄鼠合笼观察生育力;对21天的小鼠行超数排卵,统计获卵数;分别取21天和6周龄小鼠卵巢组织脱水、石蜡包埋,对组织切片行HE染色、ZP3免疫组织化学(IHC)和过碘酸-雪夫染色(PAS),观察组织切片中各级卵泡中卵母细胞的形态。结果:p.Val134Thr点突变纯合小鼠完全不孕,杂合子小鼠生育力与野生型相比虽略有降低,但无统计学差异。超数排卵实验中,杂合子、纯合子小鼠获卵数与野生型小鼠相比均存在显著差异。杂合子小鼠获卵数约为野生型小鼠的1/2-2/3,卵母细胞透明带比野生型小鼠薄;纯合子小鼠绝大部分的卵冠丘复合物为空黏液团,少数获得的卵母细胞无透明带且大小不一,为退变裂解卵。卵巢切片HE、IHC、PAS染色示杂合子小鼠卵母细胞形态大致正常,但透明带相比于野生型小鼠略薄;纯合小鼠卵母细胞缺乏透明带。结论:p.Va1134Thr纯合突变小鼠不孕,超数排卵大多数为空黏液团,仅获得少数无透明带的退变卵母细胞,表型与空卵泡综合征患者一致。