研究背景和目的：　　Dravet综合征（Dravet syndrome，DS），一种难治性癫痫性脑病，典型表现为一岁以内生长发育正常的患儿突然出现热性或无热惊厥，以全面性或单侧阵挛或强直阵挛发作起病，以后出现多种发作类型，如肌阵挛发作、不典型失神发作、复杂局灶性发作，影响精神运动发育，常规抗癫痫药物疗效不好，预后差。Dravet综合征的分子遗传学研究显示，70-80％的患者存在钠通道SCN1A基因突变。目前有DS小鼠模型、诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSc）模型证实钠通道SCN1A基因突变导致的钠通道功能受损是主要的致痫机制。但仍约有15%的Dravet综合征患者病因未明。　　研究发现，3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR）在mRNA的翻译、亚细胞定位以及稳定性中起重要作用。通过影响RNA结合蛋白、miRNA、非编码RNA等与mRNA3′UTR的结合，在转录后水平影响基因的表达。3′UTR的异常调控将导致蛋白表达异常，从而导致疾病发生。本课题组前期对DS患者进行钠通道SCN1A基因3′UTR突变筛查时发现一个新生突变（NM_006920c.*20 A＞G）。本研究拟对钠通道SCN1A基因3 UTR发现的新生突变进行功能分析，探索其在Dravet综合征中的致病机制。　　方法：　　一、钠通道SCN1A基因3′UTR突变位点的功能分析　　1、生物信息学分析：对变异位点采用Vector NTI软件对进行保守性分析，利用RNA structure5.3对SCN1A基因3′UTR突变位点进行RNA二级结构预测。　　2、构建双荧光素酶报告基因质粒，转染人畸胎瘤细胞（NT2细胞），检测荧光素酶活性。　　3、RNA电泳迁移阻滞实验（RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay，RNA-EMSA）分析突变位点对非翻译区序列与细胞质蛋白结合的影响。　　4、荧光定量PCR检测突变位点对报告基因mRNA稳定性的影响。　　5、RNA-Protein Pull-Down及SDS-PAGE电泳分离与RNA探针结合的NT2细胞质蛋白，Nano LC/MS/MS分析鉴定RNA结合蛋白。结合蛋白EMSA实验进一步证实。　　二、GAPDH慢病毒干扰试验　　1、构建RNA结合蛋白GAPDH的慢病毒干扰质粒。　　2、慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）并筛选稳定细胞株。　　3、Western Blot检测SH-SY5Y细胞GAPDH和Nav1.1蛋白表达情况。　　结果：　　1、突变位点物种间保守性分析结果发现此位点高度保守。RNA二级结构预测发现，该突变位点显著改变RNA二级结构。　　2、构建双荧光素酶报告基因重组质粒野生型：psiCHECK2-SCN1A3U(20A)及突变型：psiCHECK2-SCN1A3U(20G)，转染NT2细胞。检测相对荧光素酶活性，与野生型相比，突变型相对荧光素酶活性降低30%（t=8.5，P＜0.01），该突变位点负性调控报告基因表达。荧光定量检测海肾荧光素酶表达，结果发现与野生型相比，突变型报告基因的mRNA半衰期缩短，突变降低报告基因稳定性。　　3、合成生物素标记的野生型(20A)及突变型(20G)RNA探针，与NT2细胞质蛋白进行RNA电泳迁移阻滞实验。结果发现有特异性的NT2细胞质蛋白与突变型结合，与野生型相比，突变型与NT2细胞质蛋白的结合力增加。　　4、RNA-Protein Pull-Down及SDS-PAGE分别分离结合蛋白得到一条蛋白条带。经Nano LC/MS/MS分析该蛋白条带可能是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。采用纯化的GAPDH蛋白做RNA-EMSA实验发现突变型探针存在特异性阻滞条带，证实此结合蛋白为GAPDH。　　5、构建 GAPDH慢病毒干扰的SH-SY5Y稳定细胞株，检测内源性 GAPDH和Nav1.1蛋白。Western Blot结果显示，与空白组和阴性对照组相比，阳性组的GAPDH表达明显下降（P＜0.01，n=3）；而阳性组的内源性Nav1.1的表达则增加明显（P＜0.01，n=3）。　　结论：　　1、DS患者中发现的钠通道SCN1A基因3′UTR新生突变（c.*20 A＞G）是功能性突变。突变导致RNA结合蛋白GAPDH与3′UTR的结合能力增强，影响报告基因mRNA的稳定性，在转录后水平负性调控钠通道SCN1A基因的表达。　　2、NM_006920c.*20 A＞G突变的致痫机制，可能是通过增强GAPDH与钠通道SCN1A基因3′UTR的结合能力，降低Nav1.1 mRNA稳定性，从而减少Nav1.1的表达，导致单倍剂量不足现象。