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高等开花植物,通过双受精产生二倍体的合子和三倍体的胚乳细胞,分别发育成胚和胚乳。为了研究受精后胚和胚乳发育的启动、初期发育过程的调节、以及胚和胚乳的发育调控网络的协调性,我们进行了拟南芥遗传突变体库的筛选,发现了一个胚胎发育受阻的突变体zar2,通过TAIL-PCR克隆了ZAR2基因,并对其作用方式和途径进行了深入研究,具体结果如下:
对Ds/Ac插入的基因陷阱和增强子陷阱的拟南芥突变体库的遗传筛选[1],我们得到113个育性降低的突变体,其中一个胚胎发育停滞的基因陷阱突变体zar2,其后代的卡那霉素抗性分离比为1.8:1(KanR:KanS=666:382)。整体透明观察约有27.82％的种子败育,其中合子发育停滞于伸长时期而导致败育的胚珠约是8.54％(n=1136),停滞发育在一细胞胚时期而导致败育的胚珠约为15.85％。激光共聚焦显微镜观察,zar2突变体的胚乳发育相对于野生型而言,在合子伸长时期胚乳发育延迟的胚珠为8.55％(n=336),在合子分裂一次的一细胞胚时期胚乳发育延迟的胚珠为16.04％,总共胚乳发育延迟的胚珠为27.05％。与野生型正反交结果表明,此突变影响胚和胚乳的发育或胚和胚乳的细胞分裂,不影响雌配子体和雄配子体的发育。所以,zar2突变体是一隐性纯合致死的突变体,因其材料的特殊性,我们用zar2(Ds/+)杂合体为研究对象。我们胚乳特异分子标记以及细胞周期分子标记遗传分析也证实,zar2影响了胚和胚乳的细胞分裂。和zar2同时分离得到的同一等位基因的不同突变体sgt5537,为Ds插入同一基因不同位点的突变体,但是没有败育的表型。Southern blot分析表明zar2为单拷贝Ds插入的杂合突变体,sgt5537为Ds单拷贝插入的纯合突变体。通过TAIL-PCR得到Ds插入的侧翼序列,进而克隆了ZAR2基因,ZAR2基因编码一个716个氨基酸的富含亮氨酸重复(LRR)的类受体蛋白激酶(LRR-RLK),属于LRRⅢ亚家族；ZAR2包含四部分:N-末端的信号肽,紧接着为7个富含亮氨酸重复的区域,然后为一段跨膜区,C端为胞内的Ser/Thr蛋白激酶区。序列分析表明zar2杂合突变体中,由于Ds的插入造成Ser/Thr蛋白激酶区缺失,产生包括一段跨膜区和整个LRR区以及部分激酶区的截短了的蛋白质:在sgt5537中,Ds插入到第7个LRR区与胞外跨膜区之间的不保守的区域,并造成8bp的正向重复,不能产生有功能的蛋白质；Real-time-PCR结果表明,ZAR2基因在根、花序、角果中都有表达,其中在配子体发生直至授粉后的3-4天的角果中高水平表达,在4-8细胞胚阶段表达水平达到最高值。RNA原位杂交结果显示,ZAR2基因从大孢子形成开始直至4-细胞胚时期的生殖相关的组织中都有表达。全长cDNA融合GFP转化植物,ZAR2-GFP荧光与膜特异的染料FM4-64共定位,证实ZAR2蛋白定位于细胞膜上。在原生质体转化试验中,ZAR2自身启动子驱动ZAR2-GFP融合基因瞬时表达,进一步证实ZAR2蛋白为细胞膜蛋白。基因互补试验证实,全长的cDNA能够互补zar2突变表型。在胚或胚乳中特异表达ZAR2基因也能够部分互补zar2突变体的表型。通过序列预测,ZAR2蛋白胞内靠近跨膜区的位置,具有一个23-25个氨基酸组成的富含极性氨基酸的钙调蛋白(CaM)结合域,在激酶保守区Ⅶ和Ⅷ之间的,靠近C-末端还含有一个8个氨基酸组成的潜在Gβ结合位点。体外pull-down试验证实,在大肠杆菌中,ZAR2激酶区(kinase domain)利用通过预测的CaM和AGB1(Gβ)结合位点分别与CaM1蛋白和AGB1(Gβ)蛋白相互作用,并且激酶区可以发生自磷酸化,但AGB1(Gβ)蛋白是否被磷酸化尚需进一步研究。体外pull-down试验同时证实,ZAR2、CaM1蛋白和AGB1(Gβ)蛋白三个蛋白,在同一个复合体中发生相互作用,形成三聚体。双分子荧光互补(BiFC)试验证实,ZAR2蛋白可以与CaM1蛋白和AGB1(Gβ)蛋白在植物体内相互作用,同时原生质体的共定位试验表明,ZAR2蛋白和CaM1蛋白共定位于质膜上,ZAR2蛋白和AGB1(Gp)蛋白也共定位于质膜上。体外pull-down试验同时证实,ZAR2与另一个LRR-RLK类受体蛋白激酶ZAR1的激酶区可以形成异源二聚体。过表达zar2突变体中ZAR2基因的截短序列(ZAR2ΔKinase)的ZAR2ΔKinase-GFP基因,转基因植株叶片的长宽比发生明显改变,主根变短,产生与agb1-2(Gβ)突变体相似的表型。我们推测ZAR2可能参与到异源三聚体G蛋白信号通路,调节细胞分裂的分子调控网络。
综上所述,ZAR2类受体蛋白激酶通过接受胞外的配体信号调控其激酶活性,与CaM1钙调蛋白、AGB1(Gβ)蛋白和ZAR1类受体蛋白激酶相互作用,从而调节合子和胚乳的细胞分裂,调控胚胎发育过程。该研究加深了我们对高等植物合子发育的调控机理的认识,并为了解LRR-RLK类受体蛋白激酶的功能提供了新的线索。