背景心室重构是指心室由于负荷增加或心肌损伤所产生的室壁厚度、组织结构、大小和形状等一系列变化,是心室整体代偿和病变修复及继发的病理生理过程,是心肌梗死后心衰的发生、发展的重要病理机制,也是决定患者心梗后心功能、预后的主要因素之一。心室重构表现为心室腔的扩大、心室壁的增厚、心肌纤维化及心功能的降低。乙醛脱氢酶2(ALDH2)是醛代谢的关键酶,研究证实ALDH2可通过加速活化性醛类清除及其他机制发挥保护心血管的作用。然而,目前对ALDH2在心血管病中的作用研究多集中急性心肌梗死或心衰阶段,ALDH2在心梗后心室重构长期发展过程中的作用及可能的作用机制尚不明确。大量动物实验和临床研究表明,补阳还五汤具有显著的防治心梗后心室重构的作用,其作用机制是多途径、多靶点的,何目前未有关于补阳还五汤是否通过ALDH2途径抗心室重构的报道。目的探讨ALDH2在心梗后远期心室重构中的作用及可能的作用机制;探讨补阳还五汤是否通过调控ALDH2发挥抗心室重构的作用。方法本研究将分成两部分进行:在第一部分研究,通过结扎大鼠冠状动脉前降支制备心肌梗死模型,使用ALDH2激动剂Alda-1、抑制剂daidzin干预,设立假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、Alda-l组、daidzin组,每组18只大鼠。Alda-1组大鼠给予Alda-1溶液灌胃(16mg/kg.d),daidzin组予daidzin溶液灌胃(5mg/kg.d),Model组、Sham组给予等容积蒸馏水灌胃,每日分2次灌胃,连续给药20周。通过观察各组大鼠生存率,心脏超声检测心功能,测量大鼠体重、心脏重量,并计算心脏质量指数,大鼠心脏组织固定切片后进行HE染色检测心肌组织结构,Mallory染色检测心肌纤维化程度,测量心肌胶原纤维容积分数,采用免疫组化法对心肌I型胶原、III型胶原的表达量进行检测,通过 TUNEL 染色、Caspase-3 活性及 Western-Blot 法检测 P53、Bax、Bcl-2 蛋白表达评估心肌细胞凋亡情况,Western-Blot法检测ALDH2表达,ALDH2酶活性检测试剂盒检测ALDH2酶活性变化,免疫组化法检测4-HNE表达,以明确ALDH2在心梗后心室重构的作用及作用机制。第二部分研究,通过结扎大鼠冠脉前降支制备心肌梗死动物模型,造模成功大鼠随机分为模型组(Model组)、Alda-1组、补阳还五汤组、培哚普利组,另设假手术组(Sham组),每组18只大鼠。Alda-1组予Alda-1溶液灌胃(16mg/kg.d),补阳还五汤组大鼠予补阳还五汤中药汤剂灌胃(相当于生药15g/kg.d),培哚普利组予培哚普利溶液灌胃(0.41mg/lkg.d),Sham组、Model组给予等容积蒸馏水灌胃,每日分2次灌胃,连续给药20周。通过生存率观察,心脏彩超检测心功能,HE染色评估心肌病理变化,Mallory染色检测心肌纤维化程度,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,Western-Blot法检测ALDH2的表达,ALDH2酶活性测试试剂盒检测ALDH2酶活性,免疫组化法检测4-HNE的表达,以明确补阳还五汤治疗心梗后远期心室重构的作用,并探讨是否通过ALDH2途径改善心梗后心室重构及其中的作用机制。结果1.ALDH2在心梗后心室重构中作用研究1.1 ALDH2激动剂、抑制剂对大鼠生存率的影响共有72只大鼠参与实验,每组18只,至实验观察终末,共存活55只大鼠,其中假手术组17只,模型组10只,Alda-1组15只,daidzin组13只。假手术组大鼠死亡率为5.6%,模型组大鼠死亡率为44.4%。Alda-1组大鼠死亡率16.7%,daidzin组死亡率为27.78%。大鼠死因考虑为心力衰竭。1.2 ALDH2激动剂、抑制剂对心脏质量指数、心脏病理、心脏功能的影响不同分组大鼠的心脏质量指数差异具有显著性(F=171.17,P<0.001)。与Sham组相比,Model组大鼠的心脏质量指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)。Alda-1组大鼠的心脏质量指数明显下降,与Model组相比有统计学差异(P<0.001)。与Model组相比,daidzin组心脏质量指数无明统计学差异(P=0.107)。光镜下观察心脏HE染色结果。Sham组:心肌细胞排列整齐,心肌纤维结构清晰,肌丝无断裂,着色均勾,细胞界限清晰。Model组:心肌梗死区可见大量增生的胶原纤维组织,非梗死区心肌细胞肿胀、肥大,形态不规则,细胞核大而深染,心肌纤维增粗。Alda-1组:大部分心肌组织排列均匀,心肌细胞稍肿胀,心肌细胞间有少量胶原纤维组织。daidzin组:可见心肌细胞肥大、排列紊乱,大量纤维组织充填,但与Model组相比,daidzin组心肌细胞肥大与纤维化程度均稍减轻。从400倍光学显微镜每个视野下心肌细胞数量的统计结果来看,不同组别大鼠单位视野下心肌细胞数量具有显著性差异(F=95.477,P<0.00丨)。与Sham组相比,Model组大鼠的单位视野下心肌细胞数量明显减少(P<0.001),说明心梗后心肌细胞肥大情况明显。与Model组相比,Alda-l组大鼠心肌细胞数量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。daidzin组心肌细胞数量与Model组比差异无统计学意义(P=0.139),但daidzin组有升高的趋势。药物干预20周后,经胸心脏彩超检测大鼠心功能结果显示不同分组的火鼠LVEF比较有统计学差异(F=301.4,尸<0.001)。与Sham组相比,Model组大鼠LVEF明显下降,与Sham组比较有统计学差异(P<0.001)。Alda-1组的LVEF指标显著高于Model组,与Model组比较有统计学差异(P<0.001)。daidzin组的LVFS指标与Model组比较,差异无统计学意义(P=0.970)。不同分组LVFS差异有显著性(F=152.321,P<0.001)。与Sham组相比,Model组的LVFS明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。Alda-1组的LVFS高于Model组,与Model组比较差异有统计学意义(P<0.001)daidzin组与Model组比较没有统计学差异(P=0.471)。不同分组的LVIDd差异有显著性(F=250.961,P<0.001)。与Sham组相比,Model组的LVIDd明显上升,差异有统计学意义(P<0.001)。Alda-l组的LVIDd下降,与Model组比较差异有统计学意义(P<0.001)。daidzin组的LVIDd有较Model组下降的趋势,但两组比较差异无统计学意义(P=0.680)。不同分组LVIDs差异有显著性(F=349.251,P<0.001)。Model组的LVIDs明显上升,与Sham组比较有统计学差异(尸<0.001)。与Model组比较,Alda-1组的LVIDs降低,差异有统计学意义(P<0.001)。daidzin组的的LVIDs有低于Model组的趋势,但两组间数据比较无统计学差异(P=0.529)。1.3 ALDH2激动剂、抑制剂对大鼠心梗后心肌纤维化的影响Mallory染色检测心梗给药20周大鼠心肌纤维化的情况,结果显示不同组别的胶原容积分数(CVF)差异具有显著性(F=125.458,P<0.001)。Sham组仅有少量散在染成蓝色的胶原纤维形成。Model组大鼠心肌可见大量排列紊乱的纤维组织,与Sham组相比,Model组大鼠的心肌胶原纤维容积分数(CVF)显著上升,差异具有统计学意义(P<0.001)。Alda-1组可见少量胶原纤维,心肌纤维化程度较Model组明显减轻,CVF减少(P<0.001),但仍达不到Sham组的状态。daidzin组可见大量胶原纤维纤维形成,排列紊乱,在CVF指标上与Model组相比无统计学差异(P=0.327),但daidzin组纤维化程度有较Model组减轻的趋势。免疫组化法检测大鼠心肌非梗死区I型胶原、III型胶原纤维的表达程度,不同组别I型、III型胶原表达量具有显著性差异(分别为F=114.584,P<0.001;F=60.095,P<0.001);不同组别I型/III型胶原比值具有显著性差异(F=87.886,P<0.001)。Sham组可见少量I型、III型胶原表达,无纤维化表现。与Sham组相比,Model组的I型、III型胶原表达明显增加,具有统计学差异(分别为P<0.001;P<0.001),其中I型胶原增加程度大于Ⅲ型胶原,I/III胶原的表达比值上升,与Sham组相比差异具有显著性(P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组I型、III型胶原表达及I/III比值均显著下降,差异具有统计学差异(分别为P<0.001;尸<0.01;P<0.001)。与Model组相比,daidzin组I型、III型胶原纤维表达及I/III比值无统计学差异(分别为P=0.177;尸 P=135;尸=0.079),但呈现出比Model组降低的趋势。1.4 ALDH2激动剂、抑制剂对大鼠心肌细胞凋亡的影响通过TUNEL染色,P53、Bax、Bcl-2蛋白电泳及Caspase-3活性检测来评估心肌细胞凋亡情况。TUNEL染色结果显示各组大鼠细胞凋亡指数差异具有显著性(F=326.88,P<0.00l)。Sham组仅见少量全核被染成棕色的凋亡细胞。Model组大鼠心肌细胞核被染成全棕色的凋亡细胞明显增多,凋亡指数上升,与Sham组相比具有差异统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组大鼠心肌凋亡细胞明显减少,凋亡指数下降,差异具有统计学意义(p<0.001)。daidzin组心肌细胞凋亡较Model组增多,凋亡指数上升,差异具有统计学意义(P=0.021)。Western-blot法检测各组大鼠心肌促凋亡蛋白P53、Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,结果显示不同组别中P53、Bax、Bcl-2的表达差异具有显著性(分别为F=36.006,P<0.001;F=29.305,P<0.001;F=62.345,P<0.001)。Model组促凋亡蛋白P53、Bax表达较Sham组明显上升,差异具有统计学意义(分别为P<0.001,P<0.001),抑凋亡蛋白Bcl-2表达下降(尸<0.001),Bax/Bcl-2比值上升(P<0.001)。与Model组相比,Alda-l组的P53、Bax表达降低(分别为P<0.001,P<0.05),Bcl-2表达上升(P<0.001),Bax/Bcl-2比值下降(P<0.001)。相反,与Model组相比,daidzin组的P53、Bax表达增加(分别为P<0.001,尸<0.05),Bcl-2表达下降(P<0.001),Bax/Bcl-2比值上升(P<0.001)。Caspase-3活性检测试剂盒对心肌细胞Caspase-3活性进行检测,结果显示各组间Caspase-3活性差异具有显著性(F=618.797,P<0.001)。与Sham组相比,Model组的Caspase-3活性明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组的Caspase-3活性降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。daidzin组的caspase-3活性显著上升,与Model组相比,差异具有统计学意义(P<0.001)。1.5 ALDH2激动剂、抑制剂对心肌ALDH2表达、ALDH2酶活性的影响采用Western-blot法检测心肌ALDH2表达情况,结果显示出Model组、Alda-1组、daidzin组均比Sham组表达明显下降,但Model组、Alda-1组、daidzin组之间无差异。采用ALDH2酶活性试剂盒对心肌ALDH2酶活性进行检测,结果显示不同组别的ALDH2酶活性差异有统计学意义(F=322.304,P<0.001)。与Sham组相比,Model组的ALDH2酶活性均显著下降(P<0.001),Alda-1组、daidzin组也较Sham组下降,与Sham组相比差异具有统计学意义(分别为P<0.01;P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组的ALDH2酶活性明显增高,差异具有统计学意义(P<0.001)。daidizn组的ALDH2酶活性较Model组降低,与Model组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。1.6 ALDH2激动剂、抑制剂对大鼠4-HNE表达的影响采用免疫组化法检测各组大鼠心肌4-HNE表达情况,结果显示不同分组之间4-HNE阳性率差异具有显著性(F=158.046,P<0.001)。与Sham组相比,Model组大鼠的4-HNE阳性表达细胞明显增多,阳性率增高,差异具有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组的4-HNE表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。daidzin组的4-HNE阳性细胞较Model组增多,4-HNE阳性率与Model组相比差异有统计学意义(P<0.001)。2.补阳还五汤通过调控ALDH2影响心室重构的机制研究2.1补阳还五汤对大鼠生存率的影响共有90只大鼠纳入实验,到实验观察终末,第二大实验组共存活71只大鼠,其中Sham组17只,Model组10只,补阳还五汤组14只,Alda-1组15只,培哚普利组15只。Sham组死亡大鼠1只(死亡率5.6%),Model组大鼠死亡8只(死亡率44.4%),补阳还五汤组死亡4只(22.2%),Alda-1组死亡3只(死亡率16.7%),培哚普利组死亡3只(死亡率16.7%),死亡动物病理解剖未见到心脏破裂,死亡原因考虑主要为心力衰竭。2.2补阳还五汤对心脏质量指数、心脏病理、心脏功能的影响不同组间心脏质量指数(HW/BW)具有显著性差异(F=15.729,P<0.01)。与Sham组相比,Model组心脏质量指数显著上升,差异有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,补阳还五汤组大鼠心脏质量指数明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,Alda-l组大鼠心脏质量指数下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。培哚普利组心脏质量指数较Model组下降(P<0.001)。补阳还五汤组、Alda-1组与培哚普利组相比,无统计学差异(分别为P=0.419;P=0.493)。光镜下观察心脏HE染色结果。Sham组:心肌着色均勾,横纹排列整齐,细胞之间界限清晰,间隙均匀,心肌细胞排列整齐。Model组:心肌细胞肿胀变大,细胞形态不规则,细胞核大而深染,排列紊乱,心肌纤维增粗、变长、排列紊乱,心肌纤维之间间隙增宽,可见大量染色较淡的胶原纤维组织。补阳还五汤组:心肌细胞轻度肿胀,排列稍紊乱,心肌细胞间可见少量的纤维组织;与Model组对比,心肌细胞排列较整齐,心肌细胞肥大、肿胀明显减轻,纤维增生程度减弱。Alda-1组:心肌细胞轻度肿胀,排列稍紊乱,心肌细胞间可见少量的纤维组织;与Model组对比,心肌细胞排列紊乱、心肌细胞肥大、肿胀明显改善,纤维增生程度减弱。培哚普利组仅见少量的胶原纤维,细胞轻微肿胀、肥大,心肌细胞稍紊乱,但上述情况较Model组明显减轻。400倍光学显微镜单个视野下心肌细胞数量的统计结果显示,各组单位面积下心肌细胞数量具有显著性差异(F=66.46,P<0.001)。与Sham组相比,Model组大鼠的心肌细胞肿胀、肥大,心肌细胞数量明显减少(P<0.001)。与Model组相比,补阳还五汤组心肌细胞数量明显增多,具有统计学差异(尸<0.001)。Alda-1组大鼠心肌细胞数量较Model组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,培哚普利组的心肌细胞数量也呈现明显升高趋势,差异具有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤组、Alda-1组与培哚普利组比较,差异无统计学意义(分别为:P=0.552;P=0.191)。药物干预20周后,用经胸心脏彩超检测各组大鼠心功能。结果显示不同分组LVEF差异有显著性(F=93.287,P<0.01)。与Sham组相比,Model组的LVEF下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤组及Alda-1组的LVEF上升,与Model组比较有统计学差异(P<0.001)。培哚普利组的LVEF明显高于Model组,与Model组比较差异有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤、Alda-1组的LVEF与阳性对照药物培哚普利相比,差异无统计学意义(分别为 P=0.393;P=0.39)。不同分组LVFS差异有显著性(F=93.287,P<0.01)。与Sham组相比,Model组的LVFS显著下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤组的LVFS明显上升,与Model组比较有统计学差异(P<0.001);Alda-1组的LVFS指标高于Model组,与Model组比较差异有统计学意义(P<0.001)。与Model组比较,培哚普利组的LVFS上升,差异有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤组、Alda-1组的LVFS与培哚普利组相比,差异无统计学意义(分别为 P=0.597;P=0.629)。不同分L组VDDd差异有显著性(F=27.886,P<0.001),与Sham组相比,Model组的LVIDd显著上升,差异有统计学意义(P<0.01)。补阳还五汤组的LVIDd明显下降,与Model组比较有统计学差异(P<0.01)。Alda-丨组的LVIDd明显低于Model组,与Model组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与Model组相比,培哚普利组的LVIDd下降,差异有统计学意义(P<0.01)。补阳还五汤组、Alda-1组的LVIDd与培哚普利组比较无统计学意义(P=0.843,P=0.810)。不同分组LVIDs差异有显著性(F=152.591,P<0.01)。与Sham组比,Model组的LVIDs明显上升,差异具有统计学意义(P<0.01)。与Model组比,补阳还五汤组的LVIDs明显下降,具有统计学差异(P<0.01),Alda-1组的LVIDs低于Model组,与Model组比较差异有统计学意义(P<0.01)。培哚普利组的LVIDs显著低于Model组,与Model组比较差异有统计学意义(尸<0.01)。补阳还五汤组、Alda-1组与培哚普利组相比,无统计学差异(P=0.744,P=0.711)。2.3补阳还五汤对大鼠心梗后心肌纤维化的影响Mallory染色检测心梗给药20周大鼠心肌纤维化的情况。结果显示不同组别大鼠胶原纤维容积分数(CVF)差异具有显著性(F=161.820,P<0.001)。Sham组仅见少量胶原纤维形成。Model组在鼠心肌纤维化明显,梗死区及非梗死区均可见大量排列紊乱的纤维组织填充。与Sham组比,Model组心肌CVF显著上升,具有显著性差异(P<0.001)。补阳还五汤组仅有散在染成蓝色的胶原纤维形成,CVF较Model组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组心肌纤维化明显减轻,CVF明显减少(P<0.001)。培哚普利组可见少量胶原纤维形成,CVF较Model组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤组、Alda-1组与培哚普利组比较差异均无统计学意义(分别为P=0.838;P=0.923)。2.4补阳还五汤对心肌细胞凋亡的影响用TUNEL试剂盒检测左室非梗死区心肌细胞凋亡水平,结果显示不同组别凋亡指数差异具有显著性(F=236.799;P<0.001)。与Sham组比,Model组凋亡细胞明显增多,凋亡系数显著上升,差异具有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤组心肌细胞核被染成全棕色的凋亡细胞明显减少,凋亡指数较Model组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组心肌凋亡细胞减少,凋亡指数下降,差异具有统计学意义(尸<0.001)。培哚普利组凋亡指数较Model组下降,差异有统计学意义(P<0.001)。补阳还五汤组、Alda-l组与培哚普利组比,差异无统计学意义(分别为P=0.688;P=0.10)。2.5补阳还五汤对心肌ALDH2表达、ALDH2酶活性的影响采用Western-Blot法检测心肌ALDH2表达情况,结果显示不同组间ALDH2表达量具有显著性差异(F=72.71,尸<0.001)。与Sham组相比,Model组的ALDH2表达显著降低(尸<0.001),Alda-1组、培哚普利组的ALDH2表达与Model组相比无显著性差异(分别为P=0.857,P=0.829),补阳还五汤组ALDH2表达较Model组升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。采用ALDH2酶活性试剂盒对大鼠心肌ALDH2酶活性进行检测,结果显示各组之间数据差异有显著性(F=317.809,P<0.001)。与Sham组比,Model组的ALDH2酶活性显著下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。与Model组相比,补阳还五汤组的ALDH2酶活性明显上升,差异具有统计学意义(P<0.001)。Alda-1组的酶活性较Model组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。培哚普利组与Model组相比差异无统计学意义(P=0.092),但有提高ALDH2酶活性的趋势。2.6补阳还五汤对大鼠4-HNE表达的影响采用免疫组化法检测各组大鼠心肌4-HNE表达情况,结果显示不同分组4-HNE阳性率差异具有显著性(F=234.69,P<0.001)。与Sham组相比,Model组的4-HNE表达明显增高,4-HNE阳性率显著上升,差异具有统计学意义(尸<0.001)。与Model组相比,补阳还五汤组的4-HNE阳性表达细胞明显减少,阳性率下降(P<0.001)。与Model组相比,Alda-1组的4-HNE表达也明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。培哚普利组的4-HNE阳性细胞较Model组减少,与Model组相比差异有统计学意义(P<0.05),但下降幅度远不及补阳还五汤组和Alda-1 组。结论1.心梗后ALDH2蛋白表达量、酶活性均明显下降,醛负荷增加,可能是心梗后心室重构的一个重要机制.2.ALDH2激动剂通过提高ALDH2酶活性降低醛负荷发挥抗心室重构的作用,改善心梗大鼠远期生存率。3补阳还五汤是治疗心室重构的有效药物,其机制可能与提高ALDH2酶活性和ALDH2表达,降低醛负荷有关。