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本工作通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA插入突变体库的筛选,得到一个对细胞分裂素反应异常,生长较快的突变体gfc1(grow fast on cytokinin,gfc)。基因克隆和序列分析结果表明该突变基因编码一种BAHD基因家族的酰基转移酶。该家族成员在许多植物次生代谢物合成途径中具有重要的作用。在许多植物中催化了植保素合成的第一个反应。模式植物拟南芥中有70多个该基因家族成员,然而目前这些基因编码的酶的作用底物及产物尚不明确。
gfc1等位突变体gfc2在含TDZ0.1mg/l的MS培养基上时,具有同gfc1一致的表型,而不同来源的两个T-DNA插入失活突变体,在同一位点发生自然突变的几率几乎是0,由基因和表型的连锁关系可以确定突变体的表型是由该基因引起的。
突变体gfc1为父本,野生型为母本杂交得到FlBC1,杂交成功的幼苗为Kamr,进行PCR纯杂合验证均为杂合体。另取一部分FlBC1接种于含TDZ 0.1mg/l的MS培养基上,发现gfcl突变表型丧失而显示野生型表型,证明为隐性突变体。
表型分析显示,在MS基本培养基上培养10天的突变体与野生型,gfcl的根长长于野生型,二者下胚轴长度相差不大,突变体略短些。转移到土壤中培养后,二者在营养生长期生长状况没有明显区别。
在含细胞分裂素的MS培养基上,gfcl的根生长明显比野生型快,上部形态差异明显,叶片较野生型生长快,而下胚轴相对略短。推测可能是gfcl中细胞分裂素信号转导过程受到影响,使得gfcl对细胞分裂素不敏感。而在含有生长素的MS培养基上,突变体与野生型表型相差不大,说明突变基因未影响内源生长素的信号途径。
HPLC法测定内源激素水平的结果来看,经TDZ处理6小时后,野生型和gfcl的内源IAA的水平都有所下降,而野生型下降程度较gfcl更显著。推测可能是因为外源细胞分裂素添加后,抑制了内源IAA含量的下降。
半定量RT-PCR结果显示,gfcl在野生型拟南芥花序中表达量最高,按表达量递减的顺序,依次为角果、幼嫩叶片、花序茎、成熟叶片、根以及衰老叶片。试验结果同genevestigator网站公布的基因芯片测定结果总体上保持一致的。
以含TDZ的MS培养基上的突变体及野生型拟南芥叶片为材料制作半薄切片,光学显微镜下观察并以成像系统分析,野生型叶肉细胞排列较gfcl紧密,且细胞略小,而突变体中叶肉细胞排列相对松散。本实验已克隆到gfc1启动子序列,需进一步构建cDNAgfc1-pBI121、全长gfc1-pCAMBIA1300、启动子Pgfc1-pBI121载体,完成分子互补,Gus染色等实验。另外,作为植保素合成途径的一个关键的酶,了解其生化活性等对于抵御病害具有特殊重要的作用。