矮牵牛(Petunia hybrida)既是一种研究花发育机理的模式植物,也是一种园林中广泛应用的花坛花卉。近些年来,人们对矮牵牛的花发育的MADS-BOX基因的研究甚多,研究的重点也主要集中在C、D、E类同源基因的克隆及功能分析和验证上。Real-time PCR和原位杂交实验表明,矮牵牛C类基因(例如FBP6,pMADS3)主要在第三轮花器官的花药、心皮中表达,D类基因(例如FBP7,FBP11)专一的控制胚珠原基、珠被和珠柄的形成,E类基因(例如FBP2,FBP5)的表达模式比较复杂,参与了四轮花器官的形成。为了更加深入的了解这些控制花器官形成基因的调控机理以及相互之间的作用关系,从而更好的为园林植物遗传育种提供理论技术依据,本研究以矮牵牛为材料,利用染色体步移中的TAIL-PCR技术获得部分矮牵牛花发育C、D、E类基因的启动子序列,通过生物信息学、组织化学染色、GUS活性荧光定量分析、启动子区域缺失和凝胶阻滞电泳等方法对启动子功能进行预测与验证分析。结合各项分析结果,利用启动子的组织特异性特征,实现特殊基因的异位表达,通过基因工程的手段实现花器官形态与结构的定向改造,为人工定向育种提供了技术支撑。主要研究结果如下：1、结合文献中对花发育基因研究进展的报道,本研究选取矮牵牛C类基因FBP6,D类基因FBP11,E类基因FBP2为代表,根据NCBI数据库中已经公布的FBP6,FBP11,FBP2基因的mRNA序列,利用TAIL-PCR的方法,分别克隆得到这三个基因起始密码子上游2661bp,3133bp,980bp的启动子区域的序列。利用PLACE和PlantCARE数据库对分离克隆的启动子序列进行顺式作用元件分析预测后发现,这些序列中除包含TATA-box与CAAT-box等启动子核心启动子元件外,还含有一些与组织特异性表达相关的元件：比如花粉特异性表达元件AGAAA和GTGA,胚乳特异性表达元件CATGCATSCMH和CATCGATCGR等,初步预测这些启动子可能具备组织特异性表达功能。3、将分离克隆的这些启动子分别与报告基因GUS融合构建表达载体转化烟草,经过组织化学染色和GUS活性荧光定量分析初步检测其调控模式。发现这三类基因启动子均不能驱动GUS基因在营养器官中表达,C类基因FBP6启动子能够驱动GUS基因在雄蕊、心皮中表达,D类基因FBPll启动子能够驱动GUS基因在胚珠中特异表达,E类基因FBP2启动子则驱动GUS基因在四轮花器官均有表达。实验结果显示,FBP6、FBP1l启动子都具备组织(器官)特异性,可以驱动目的基因在特定的部位专一地表达,利用这一特征可应用于基因工程定向育种改良。3、利用生物信息学的方法,通过PLACE、PlantCARE等数据库对这些分离克隆的启动子序列进行预测分析,发现启动子区域中存在多种顺式作用元件,结合预测分析的结果,本实验设计了一系列的5’端缺失的启动子片段融合报告基因GUS构建表达载体,然后转化烟草进行分区段分析启动子的调控模式,并且已经初步获得一些影响启动子表达调控的顺式作用元件的存在区段。4、结合启动子5’端缺失实验结果,利用FBP6基因启动子-2600bp,FBPll基因启动子-1800bp的片段融合核酸酶BARNASE基因,转化烟草或番茄。结果显示表达载体pFBP6::BARNASE转化烟草85%以上植株出现柱头消融,花苞脱落,而且98%以上的花苞在开放之前从花梗靠上1/3处断裂,通过RT-PCR及对花器官生长素吲哚乙酸含量的测定,初步解释为柱头的消融导致内源生长素的合成量降低,可能间接促成了花梗处离层的形成,致使花芽脱落。表达载体pFBP11::BARNASE转基因烟草全部出现子房干瘪、无籽,可以解释为pFBP11启动子调控核酸酶BARNASE基因特异地在胚珠部位特异表达,导致胚珠消融,从而不能发育成种子。而表达载体pFBP11::BARNASE转基因番茄全部都不能形成果实,但当在果实形成初期及时在柱头涂抹合适浓度的生长素时,部分植株又能形成果实,解剖果实发现没有种子或者种子发育不良。这也再次验证了种子在形成过程中产生的生长素对果实果肉的发育起着决定性的作用。5、通过BLAST发现,在D类基因FBP11的5’-UTR区存在一个827bp的内含子,对该内含子进行功能分析发现该内含子同时具备类似启动子与增强子的功能。把该内含子插入到pCAMBIA1391Z载体的GUS基因上游时,转基因烟草能够检测到GUS基因表达,而且表达模式还存在着一定的组织特异性；同时,把该内含子插入到表达载体pB1121的35S启动子与GUS基因之间时,发现转基因烟草中GUS表达量比没有内含子时要高出3-9倍,而且内含子的插入方向也影响GUS基因的表达强弱。