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背景和目的：
气道炎症是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、哮喘?支气管炎等多种慢性呼吸道疾病的核心病理特征，与气道高反应?气道粘液高分泌及气道重塑等病理过程密切相关?气道炎症反应的发病机制十分复杂，吸烟?空气污染等介导的氧化应激反应是其主要诱因之一，气道炎症水平与慢性呼吸道疾病的临床转归密切相关?
Ca2+是细胞内作用广泛的第二信使，与细胞能量代谢、生长、增殖、凋亡等细胞生命活动密切相关?研究表明，细胞膜上大多数钙通道具有氧化还原敏感性，在氧化应激刺激下，胞内钙库释放，或细胞外Ca2+通过膜上钙通道进入细胞内，细胞内钙稳态失衡?COPD?哮喘?肺间质纤维化等多种慢性肺疾病患者或模型小鼠气道上皮细胞?气道平滑肌细胞等细胞内[Ca2+]i显著增加。故推测，在大气污染物介导的氧化应激反应中，Ca2+参与调控气道炎症反应过程。
瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道为一类跨膜非选择性阳离子通道大家族，在哺乳类动物呼吸道、肺、肾脏、心、肝、脑等多种系统组织广泛分布，分为TRPC(canonical)?TRPM(melastatin)?TRPA(ankyrin)?TRPP(polycystin)?TRPV(vanilloid)?TRPML(mucolipin)和TRPN(DrosophilaNOMPC)这7个亚族?经典瞬时受体电位6(transient receptor potential canonical 6，TRPC6)是TRPC家族(TRPC1-7)中的一员，是位于细胞膜上的对Ca2+具有高通透性的非选择性阳离子通道蛋白?TRPC6通道蛋白是肺组织表达最丰富的TRPC通道成员。大量研究表明，TRPC6通道与呼吸系统多种重要病理生理过程密切相关，有可能成为慢性呼吸道疾病治疗的关键靶点。本课题组的前期研究发现，在O3暴露介导的小鼠气道炎症反应中，气道上皮细胞TRPC6表达显著上调，推测TRPC6通道参与调控O3介导的气道炎症反应。
本课题首先以过氧化氢作为刺激因子，在细胞水平探讨TRPC6在过氧化氢致气道上皮细胞炎症反应的作用；在细胞水平探讨TRPC6通道蛋白在臭氧致气道上皮细胞炎症反应的作用；细胞水平探讨TRPC6通道参与调控氧化应激介导的气道炎症反应的可能机制；最后，动物水平观察抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC )以及TRPC6基因敲除对O3暴露引起的小鼠气道炎症反应的影响，探讨在氧化应激介导的气道炎症反应中NAC及TRPC6的作用。
方法：
1.H2O2对人气道上皮细胞钙稳态的影响及机制，以及对细胞活性的影响：体外培养人气道上皮细胞株16HBE细胞及原代人支气管上皮细胞，采用活细胞钙成像技术，观察H2O2对细胞内钙稳态的影响。利用TRPC6shRNA基因沉默方法抑制TRPC6蛋白表达以及TRPC6特异性抑制剂抑制TRPC6通道活性，明确TRPC6通道是否参与H2O2致人支气管上皮细胞钙稳态失衡过程。CCK8法观察不同浓度、不同作用时间H2O2对16HBE细胞活性的影响。
2.探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控H2O2致16HBE细胞炎症因子释放过程：不同浓度、不同作用时间的H2O2刺激16HBE细胞后收集细胞上清液，酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组中IL-6、IL-8及TNF-α蛋白质水平；分别在细胞外液无Ca2+、抑制TRPC6蛋白表达或通道活性条件下，H2O2刺激细胞，收集细胞上清液，检测各组中炎症因子分泌水平。
3.探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控O3暴露致16HBE细胞炎症因子释放过程：CCK8法检测O3暴露不同时间对16HBE细胞活性的影响；100ppbO3暴露16HBE细胞不同时间后，收集细胞上清液，检测各组中IL-6、IL-8及TNF-α蛋白质水平；细胞外液无Ca2+、抑制TRPC6蛋白表达及通道活性条件下，O3攻击细胞，收集细胞上清液，检测各组中炎症因子分泌水平。
4.探讨TRPC6通道参与调控氧化应激介导的气道炎症反应的可能机制：观察O3攻击气道上皮细胞对H2O2介导的细胞内钙稳态失衡的影响，探讨是否与TRPC6通道有关。WesternBlot、免疫荧光化学法(Immunofluorescence，IF)观察H2O2、O3对气道上皮细胞TRPC6蛋白磷酸化及总蛋白表达、膜转位的影响；WesternBlot法观察H2O2、O3刺激对ERK信号转导通路磷酸化水平的影响，以及抑制TRPC6蛋白表达后，ERK通路磷酸化水平的变化。
5.动物水平探讨TRPC6在臭氧介导的小鼠气道炎症反应中的作用：分别将C57BL/6野生型(Wide Type，WT)小鼠、TRPC6基因敲除(TRPC6 Knock Out，TRPC6 -/-)小鼠随机分为对照组及O3组。各组小鼠于第1、3、5天在1.0ppmO3或新鲜空气中暴露3h。末次暴露24h后检测各组小鼠肺组织形态学变化并进行炎症评分，测定BALF中总蛋白、IL-6、IL-8、TNF-α含量，以及肺组织匀浆液中MDA含量。WesternBlot法检测各组小鼠肺组织ERK蛋白表达水平。
6.探讨NAC对O3暴露引起的小鼠气道炎症反应的影响：C57BL/6小鼠随机分为对照组、O3组、O3+NAC组以及NAC组，于第1、3、5天在1.0ppmO3或新鲜空气中暴露3h，每次暴露前1h腹腔注射100mg/kgNAC或生理盐水。末次暴露24h后检测各组小鼠肺组织形态学，测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveo-larlavagefluid，BALF)中的总白细胞数、白细胞分类计数、蛋白含量，测定肺组织匀浆液中IL-6、IL-8以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。
结果：
1．H2O2对人气道上皮细胞钙稳态的影响及机制，以及对细胞活性的影响：H2O2可浓度依赖性双峰状升高16HBE细胞[Ca2+]i，引起细胞内钙稳态失衡；在细胞外液无Ca2+存在，H2O2仅能引起人支气管上皮细胞出现短暂[Ca2+]i上升；抑制TRPC6表达以及通道活性，均可显著降低H2O2引起的[Ca2+]i上升水平(p＜0.01)；H2O2可浓度及时间依赖性影响16HBE细胞活性。
2．探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控H2O2致16HBE细胞炎症因子释放过程：H2O2浓度、时间依赖性上调16HBE细胞IL-6?IL-8分泌水平(p＜0.01)，但不影响TNF-α分泌水平；在细胞外液无Ca2+，或抑制TRPC6表达、通道活性均可显著降低H2O2介导的IL-6?IL-8分泌水平(p＜0.01)。
3．探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控O3暴露致16HBE细胞炎症因子释放过程：100ppbO3连续暴露16HBE细胞0-12h，不影响细胞活性(p＞0.05)；100ppbO3暴露攻击16HBE细胞3h可使细胞IL-6分泌水平显著上调(p＜0.01)，6h可使IL-8分泌水平显著上调(p＜0.01)，暴露6h后继续培养12、24h，IL-6、IL-8分泌均进一步增加，差异具有显著性(p＜0.01)；以上不同处理时间均不影响TNF-α分泌水平(p＞0.05)；当细胞外液无Ca2+，或抑制TRPC6表达、通道活性均可显著降低IL-6?IL-8分泌水平(p＜0.01)。
4．探讨TRPC6通道参与调控氧化应激介导的气道炎症反应的可能机制：O3暴露显著上调H2O2介导的[Ca2+]i上升水平(p＜0.01)；抑制TRPC6表达可显著抑制O3暴露引起的上述反应。H2O2、O3可显著上调人气道上皮细胞TRPC6蛋白磷酸化、总蛋白表达及膜转位水平(p＜0.01)，上调16HBE细胞ERK磷酸化水平(p＜0.01)，抑制TRPC6表达可显著降低ERK磷酸化水平(p＜0.01)?
5．动物水平探讨TRPC6在臭氧介导的小鼠气道炎症反应中的作用：O3暴露可致WT及TRPC6-/-小鼠发生肺组织形态学变化，炎症评分升高，BALF中总蛋白、IL-6、IL-8、TNF-α及肺组织匀浆液中MDA含量增加(p＜0.01)，肺组织ERK蛋白表达显著增加(p＜0.01)；与WTO3组小鼠相比，TRPC6-/-O3组小鼠上述变化均显著减轻或降低(p＜0.01)。
6．探讨NAC对O3暴露引起的小鼠气道炎症反应的影响：与对照组相比，O3组小鼠肺泡壁结构明显受损，气管及血管周围有明显的炎性细胞浸润，O3+NAC组小鼠损伤较O3组明显减轻，炎性细胞浸润明显减少。O3组BALF中白细胞总数、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数和总蛋白浓度及肺组织匀浆液中IL-6、IL-8、MDA含量均较对照组明显增加(p＜0.05)，O3+NAC组以上指标明显低于O3(p＜0.05)。
结论：
1.H2O2通过激活SOCE及ROCE，引起人支气管上皮细胞[Ca2+]i水平升高，该过程与TRPC6通道有关。
2.细胞外Ca2+内流及TRPC6通道参与调控H2O2致16HBE细胞炎症因子释放过程。
3.细胞外Ca2+内流及TRPC6通道参与调控O3暴露致16HBE细胞炎症因子释放过程。
4.TRPC6为氧化应激敏感性离子通道，ERK可能是TRPC6信号通路的下游：H2O2/O3激活TRPC6通道，介导Ca2+内流，从而激活ERK信号通路，调控气道上皮炎症反应。
5.TRPC6通道参与调控O3暴露致小鼠气道炎症反应过程。
6.预防性给予NAC可以减轻由O3暴露引起的小鼠气道炎症反应，保护肺组织。
气道炎症是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、哮喘?支气管炎等多种慢性呼吸道疾病的核心病理特征，与气道高反应?气道粘液高分泌及气道重塑等病理过程密切相关?气道炎症反应的发病机制十分复杂，吸烟?空气污染等介导的氧化应激反应是其主要诱因之一，气道炎症水平与慢性呼吸道疾病的临床转归密切相关?
Ca2+是细胞内作用广泛的第二信使，与细胞能量代谢、生长、增殖、凋亡等细胞生命活动密切相关?研究表明，细胞膜上大多数钙通道具有氧化还原敏感性，在氧化应激刺激下，胞内钙库释放，或细胞外Ca2+通过膜上钙通道进入细胞内，细胞内钙稳态失衡?COPD?哮喘?肺间质纤维化等多种慢性肺疾病患者或模型小鼠气道上皮细胞?气道平滑肌细胞等细胞内[Ca2+]i显著增加。故推测，在大气污染物介导的氧化应激反应中，Ca2+参与调控气道炎症反应过程。
瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道为一类跨膜非选择性阳离子通道大家族，在哺乳类动物呼吸道、肺、肾脏、心、肝、脑等多种系统组织广泛分布，分为TRPC(canonical)?TRPM(melastatin)?TRPA(ankyrin)?TRPP(polycystin)?TRPV(vanilloid)?TRPML(mucolipin)和TRPN(DrosophilaNOMPC)这7个亚族?经典瞬时受体电位6(transient receptor potential canonical 6，TRPC6)是TRPC家族(TRPC1-7)中的一员，是位于细胞膜上的对Ca2+具有高通透性的非选择性阳离子通道蛋白?TRPC6通道蛋白是肺组织表达最丰富的TRPC通道成员。大量研究表明，TRPC6通道与呼吸系统多种重要病理生理过程密切相关，有可能成为慢性呼吸道疾病治疗的关键靶点。本课题组的前期研究发现，在O3暴露介导的小鼠气道炎症反应中，气道上皮细胞TRPC6表达显著上调，推测TRPC6通道参与调控O3介导的气道炎症反应。
本课题首先以过氧化氢作为刺激因子，在细胞水平探讨TRPC6在过氧化氢致气道上皮细胞炎症反应的作用；在细胞水平探讨TRPC6通道蛋白在臭氧致气道上皮细胞炎症反应的作用；细胞水平探讨TRPC6通道参与调控氧化应激介导的气道炎症反应的可能机制；最后，动物水平观察抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC )以及TRPC6基因敲除对O3暴露引起的小鼠气道炎症反应的影响，探讨在氧化应激介导的气道炎症反应中NAC及TRPC6的作用。
方法：
1.H2O2对人气道上皮细胞钙稳态的影响及机制，以及对细胞活性的影响：体外培养人气道上皮细胞株16HBE细胞及原代人支气管上皮细胞，采用活细胞钙成像技术，观察H2O2对细胞内钙稳态的影响。利用TRPC6shRNA基因沉默方法抑制TRPC6蛋白表达以及TRPC6特异性抑制剂抑制TRPC6通道活性，明确TRPC6通道是否参与H2O2致人支气管上皮细胞钙稳态失衡过程。CCK8法观察不同浓度、不同作用时间H2O2对16HBE细胞活性的影响。
2.探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控H2O2致16HBE细胞炎症因子释放过程：不同浓度、不同作用时间的H2O2刺激16HBE细胞后收集细胞上清液，酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组中IL-6、IL-8及TNF-α蛋白质水平；分别在细胞外液无Ca2+、抑制TRPC6蛋白表达或通道活性条件下，H2O2刺激细胞，收集细胞上清液，检测各组中炎症因子分泌水平。
3.探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控O3暴露致16HBE细胞炎症因子释放过程：CCK8法检测O3暴露不同时间对16HBE细胞活性的影响；100ppbO3暴露16HBE细胞不同时间后，收集细胞上清液，检测各组中IL-6、IL-8及TNF-α蛋白质水平；细胞外液无Ca2+、抑制TRPC6蛋白表达及通道活性条件下，O3攻击细胞，收集细胞上清液，检测各组中炎症因子分泌水平。
4.探讨TRPC6通道参与调控氧化应激介导的气道炎症反应的可能机制：观察O3攻击气道上皮细胞对H2O2介导的细胞内钙稳态失衡的影响，探讨是否与TRPC6通道有关。WesternBlot、免疫荧光化学法(Immunofluorescence，IF)观察H2O2、O3对气道上皮细胞TRPC6蛋白磷酸化及总蛋白表达、膜转位的影响；WesternBlot法观察H2O2、O3刺激对ERK信号转导通路磷酸化水平的影响，以及抑制TRPC6蛋白表达后，ERK通路磷酸化水平的变化。
5.动物水平探讨TRPC6在臭氧介导的小鼠气道炎症反应中的作用：分别将C57BL/6野生型(Wide Type，WT)小鼠、TRPC6基因敲除(TRPC6 Knock Out，TRPC6 -/-)小鼠随机分为对照组及O3组。各组小鼠于第1、3、5天在1.0ppmO3或新鲜空气中暴露3h。末次暴露24h后检测各组小鼠肺组织形态学变化并进行炎症评分，测定BALF中总蛋白、IL-6、IL-8、TNF-α含量，以及肺组织匀浆液中MDA含量。WesternBlot法检测各组小鼠肺组织ERK蛋白表达水平。
6.探讨NAC对O3暴露引起的小鼠气道炎症反应的影响：C57BL/6小鼠随机分为对照组、O3组、O3+NAC组以及NAC组，于第1、3、5天在1.0ppmO3或新鲜空气中暴露3h，每次暴露前1h腹腔注射100mg/kgNAC或生理盐水。末次暴露24h后检测各组小鼠肺组织形态学，测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveo-larlavagefluid，BALF)中的总白细胞数、白细胞分类计数、蛋白含量，测定肺组织匀浆液中IL-6、IL-8以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。
结果：
1．H2O2对人气道上皮细胞钙稳态的影响及机制，以及对细胞活性的影响：H2O2可浓度依赖性双峰状升高16HBE细胞[Ca2+]i，引起细胞内钙稳态失衡；在细胞外液无Ca2+存在，H2O2仅能引起人支气管上皮细胞出现短暂[Ca2+]i上升；抑制TRPC6表达以及通道活性，均可显著降低H2O2引起的[Ca2+]i上升水平(p＜0.01)；H2O2可浓度及时间依赖性影响16HBE细胞活性。
2．探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控H2O2致16HBE细胞炎症因子释放过程：H2O2浓度、时间依赖性上调16HBE细胞IL-6?IL-8分泌水平(p＜0.01)，但不影响TNF-α分泌水平；在细胞外液无Ca2+，或抑制TRPC6表达、通道活性均可显著降低H2O2介导的IL-6?IL-8分泌水平(p＜0.01)。
3．探讨细胞外Ca2+及TRPC6通道是否参与调控O3暴露致16HBE细胞炎症因子释放过程：100ppbO3连续暴露16HBE细胞0-12h，不影响细胞活性(p＞0.05)；100ppbO3暴露攻击16HBE细胞3h可使细胞IL-6分泌水平显著上调(p＜0.01)，6h可使IL-8分泌水平显著上调(p＜0.01)，暴露6h后继续培养12、24h，IL-6、IL-8分泌均进一步增加，差异具有显著性(p＜0.01)；以上不同处理时间均不影响TNF-α分泌水平(p＞0.05)；当细胞外液无Ca2+，或抑制TRPC6表达、通道活性均可显著降低IL-6?IL-8分泌水平(p＜0.01)。
4．探讨TRPC6通道参与调控氧化应激介导的气道炎症反应的可能机制：O3暴露显著上调H2O2介导的[Ca2+]i上升水平(p＜0.01)；抑制TRPC6表达可显著抑制O3暴露引起的上述反应。H2O2、O3可显著上调人气道上皮细胞TRPC6蛋白磷酸化、总蛋白表达及膜转位水平(p＜0.01)，上调16HBE细胞ERK磷酸化水平(p＜0.01)，抑制TRPC6表达可显著降低ERK磷酸化水平(p＜0.01)?
5．动物水平探讨TRPC6在臭氧介导的小鼠气道炎症反应中的作用：O3暴露可致WT及TRPC6-/-小鼠发生肺组织形态学变化，炎症评分升高，BALF中总蛋白、IL-6、IL-8、TNF-α及肺组织匀浆液中MDA含量增加(p＜0.01)，肺组织ERK蛋白表达显著增加(p＜0.01)；与WTO3组小鼠相比，TRPC6-/-O3组小鼠上述变化均显著减轻或降低(p＜0.01)。
6．探讨NAC对O3暴露引起的小鼠气道炎症反应的影响：与对照组相比，O3组小鼠肺泡壁结构明显受损，气管及血管周围有明显的炎性细胞浸润，O3+NAC组小鼠损伤较O3组明显减轻，炎性细胞浸润明显减少。O3组BALF中白细胞总数、巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数和总蛋白浓度及肺组织匀浆液中IL-6、IL-8、MDA含量均较对照组明显增加(p＜0.05)，O3+NAC组以上指标明显低于O3(p＜0.05)。
结论：
1.H2O2通过激活SOCE及ROCE，引起人支气管上皮细胞[Ca2+]i水平升高，该过程与TRPC6通道有关。
2.细胞外Ca2+内流及TRPC6通道参与调控H2O2致16HBE细胞炎症因子释放过程。
3.细胞外Ca2+内流及TRPC6通道参与调控O3暴露致16HBE细胞炎症因子释放过程。
4.TRPC6为氧化应激敏感性离子通道，ERK可能是TRPC6信号通路的下游：H2O2/O3激活TRPC6通道，介导Ca2+内流，从而激活ERK信号通路，调控气道上皮炎症反应。
5.TRPC6通道参与调控O3暴露致小鼠气道炎症反应过程。
6.预防性给予NAC可以减轻由O3暴露引起的小鼠气道炎症反应，保护肺组织。