苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，在形成芽孢的同时能够产生由一种或几种杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）组成的伴胞晶体。在芽胞形成期间产生的杀虫晶体蛋白对多种昆虫有毒性。由于这种杀虫晶体蛋白作用专一，对人畜安全，对环境无害，在许多国家和地区作为生物农药推广使用，成为迄今为止最为有效的微生物杀虫剂应用于农业害虫的生物防治。　　 海南省热带农业资源研究所从病死的蚕幼虫中分离出了一株高产菱形杀虫晶体蛋白的Bt菌株W015，本研究采用透射电镜观察、PCR-RFLP鉴定和SDS-PAGE分析等手段研究了该菌株的特性。透射电镜观察证实W015菌株主要产生菱形晶体，SDS-PAGE分析表明产生的菱形晶体为130KDa杀虫晶体蛋白，生物测定表明该晶体蛋白对鳞翅目小菜蛾具有高毒力活性。进一步的PCR-RFLP鉴定表明，该菌株含有Cry1Ac晶体蛋白基因。我们采用同源性设计的引物克隆了Cry1Ac22全长基因，序列分析显示该基因的开放阅读框（ORF）为3534bp，编码由1178个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白含有三个内毒素蛋白保守结构域，氨基酸序列与Cry1Ac1蛋白同源性为98％。该基因在GenBank上登录序号为EU282379，并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为Cry1Ac22。　　 我们将Cry1Ac22基因构建在pQE30原核表达载体上，获得重组质粒pQE30-Cry1Ac22，并经PCR、BamHⅠ和SalⅠ酶切和DNA测序鉴定验证。进一步将pQE30-Cry1Ac22转化M15宿主菌，用IPTG诱导表达出His-tag-Cry1Ac22融合蛋白。SDS-PAGE结果表明，转化了pQE30-Cry1Ac22的宿主菌表达出了分子量为133kDa的His-tag-Cry1Ac22融合蛋白，表达的融合蛋白在细胞中以包涵体的形式存在。通过进行不同的IPTG浓度和诱导温度实验，获得了1mM IPTG浓度和28℃的最佳诱导表达条件。采用Ni2-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-Cry1Ac22融合蛋白，并在体外检测纯化的目的蛋白的浓度为1177ug/ml。为采用外源性Cry1Ac22蛋白制备抗体和进行杀虫活性的测定奠定了基础。　　 为了明确Cry1Ac22蛋白在靶标昆虫体内与中肠组织的相互作用，我们将Cry1Ac22基因和绿色荧光蛋白GFP基因融合，构建含Cry1Ac22毒蛋白和绿色荧光蛋白GFP的真核表达载体，并在酵母中大量表达。荧光显微镜观察表明，表达Cry1Ac22-GFP融合蛋白的酵母在蓝光激发下发出绿色荧光，杀虫蛋白定位在酵母细胞的细胞膜上，与Cry1Ac22杀虫蛋白具有的α-螺旋跨膜结构预测相一致。利用GFP蛋白来对Cry1Ac22基因编码的蛋白在酵母细胞中进行定位，将有利于进一步了解该基因表达产物与靶标昆虫中肠的相互作用。　　 根据Cry1Ac22基因的结构，我们在全长基因及其基因功能区两端分别添加了SalⅠ和BamHⅠ酶切位点，将其连接到用SalⅠ和BamHⅠ切除了β-glucuronidase基因的pB1121植物表达载体上，得到了具有卡那霉素抗性的植物表达载体pB1121-Cry1Ac22和pB1121-Cry1Ac22domain。构建了T-DNA植物表达载体pB1121-Cry1Ac22和pB1121-Cry1Ac22domain，并经酶切、PCR扩增获得验证。将此T-DNA载体用农杆菌介导法转化开花期拟南芥，获得大量具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植物种子。