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低温甲烷古菌在高寒湿地的甲烷排放中发挥着重要作用,但目前获得纯培养的物种很少,对它们的冷适应机制也了解甚少。本实验室前期从年平均温度为1℃的若尔盖湿地分离到一株嗜冷的甲烷古菌新种-嗜冷甲烷叶菌(Methanolobus psychrophilus)R15。前期研究已完成菌株R15的基因组测序及其4℃和18℃培养物的转录组分析,发现多数基因显示低温响应的差异表达。 已知相似相容物质可保护细菌抗高渗胁迫,近年发现甲烷古菌也合成相似相容物质(如甜菜碱、谷氨酰胺等),并保护其在高盐中生长。最近Hoffmann等发现相似相容物质对Bacillus subtilis具有低温保护功能。为了分析相似相容物质在古菌冷适应中的作用,本研究分析甲烷古菌R15低温生长和冷胁迫后的相容物质积累,并在生理学和酶活水平分析相似相容物质对R15的低温保护作用。 论文第一部分利用HPLC的方法,检测到R15在低温和高渗条件下积累同一种物质,表明在古菌抗低温和抗高渗具有相关性;通过质谱、高分辨质谱鉴定积累的物质是5-甲基硫代腺嘌呤(5-methylthioadenosine,MTA)。但添加MTA反而抑制R15的生长。通过分析R15基因组、及其4℃/18℃的差异表达基因,推测胁迫条件下MTA在R15细胞中的积累可能是分解该物质的酶活降低所致。 论文第二部分分析多种已知的相似相容物质对嗜冷甲烷叶菌R15的保护作用。结果发现甘氨酸、甜菜碱、胆碱、肉毒碱、四氢嘧啶和乙偶姻6种相似相容物质促进R15在低温或高渗环境的生长。在建立了准确定量胞内甜菜碱和胆碱的LC-MS方法的基础上,检测高渗、低温及冷激条件下R15胞内甜菜碱和胆碱的变化。结果发现甜菜碱是R15主要的抗低温相似相容物质。并且发现在培养基中添加1mmol/L的甘氨酸、肌氨酸、甜菜碱或肉毒碱促进胞内胆碱的积累。而添加1mmol/L的甘氨酸、肌氨酸、二甲基甘氨酸或肉毒碱促进胞内甜菜碱的积累。以GDH酶为对象,分析发现甜菜碱、胆碱和甘氨酸能保护酶的低温稳定性。