研究背景：组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor2, TFPI-2)是一种丝氨酸蛋白酶抑制物,在维持细胞外基质结构完整性以及抑制肿瘤细胞侵袭及转移方面起着重要作用,具有抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成,并诱导细胞凋亡等多种生物功能,因此TFPI-2基因被认为是一种潜在的抑癌基因。随着后基因组时代的到来,表观遗传学研究越来越受到重视,DNA甲基化为肿瘤的表观遗传学研究开辟了一个新的领域。研究发现抑癌基因启动子区的异常甲基化可能是导致抑癌基因表达下调甚至失活的主要原因。近年来研究发现在常见的恶性肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、食管癌等恶性肿瘤组织中,TFPI-2基因CpG岛甲基化使TFPI-2表达下降或者缺失,这与恶性肿瘤的生长、浸润及转移有关。Rollin等研究发现非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) TFPI-2基因甲基化导致其表达下降能明显增加肺癌的侵袭作用,进一步研究发现,TFPI-2基因甲基化状态对肺癌的浸润、转移及预后差密切相关。Wu等研究发现NSCLC患者TFPI-2基因甲基化程度越高,预后越差。我们前期研究发现在NSCLC组织中TFPI-2基因出现了甲基化,且与临床分期、肿瘤大小及淋巴结是否转移密切相关,并推测TFPI-2基因CpG岛甲基化与NSCLC生长、浸润、转移密切相关。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)是一种DNA甲基转移酶抑制剂,通过共价键与DNA甲基转移酶形成不可逆的复合物从而抑制其活性,使DNA甲基化随细胞分裂进行性丢失,能去除肿瘤细胞的DNA甲基化,重新激活甲基化的抑癌基因,可以诱导或提高多种肿瘤抑癌基因的表达。目前5-Aza-CdR在大多数肿瘤中作用的研究仍处于实验研究阶段,临床上主要用在骨髓增生异常综合征等血液系统肿瘤的二线治疗,并取得了一定的疗效。目的：本研究采用不同浓度的5-Aza-CdR处理肺腺癌A549细胞,测定A549细胞的增殖及侵袭能力,并检测TFPI-2基因的甲基化状态及表达,观察5-Aza-CdR能否通过去甲基化而恢复TFPI-2基因在肺腺癌A549细胞中的表达,从而抑制A549细胞的增殖和侵袭,同时观察这种抑制作用是否与药物浓度密切相关。方法：1、细胞培养及分组肺腺癌A549细胞贴壁培养生长于RPMI-1640培养液,内含10%的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素,置于37℃、5%CO2的恒温闭式培养箱内培养,细胞呈贴壁生长,将对数期细胞以0.25%胰蛋白酶消化,传代。按不同浓度的5-Aza-CdR分组：对照组：未加5-Aza-CdR处理,仅加入等量普通培养液,称为0μM组。实验组：①加入1×10-6mol/1的5-Aza-CdR处理,称为1μM组。②加入5×10-6mol/l的5-Aza-CdR处理,称为5μM组。③加入10×10-6mol/l的5-Aza-CdR处理,称为10gM组。2、A549细胞增殖活性的测定取对数生长期的细胞,按每孔104个细胞,接种于96孔细胞培养板,每块培养板接种4组,每组3孔,等细胞贴壁24h后去上清液,实验组分别加入含不同浓度1、5、10×10-6mol/15-Aza-CdR的培养液,对照组加入等量普通培养液,继续置于37℃、5%CO2的恒温闭式培养箱内培养,分别于24h、48h、72h后,加入四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)溶液(10mg/l)每孔201μl,孵育4h,去除孔内上清液,每孔再加入150μl二甲基亚砜(DimethylSulfoxide,DMSO),置振荡器内振荡10min,使结晶物充分溶解。采用酶标仪检测吸光度值(optical density,OD),计算细胞增殖抑制率=(对照组OD值—实验组OD值)/对照组OD值×100%,并绘制细胞增殖曲线。实验重复三次,取均值。3、A549细胞侵袭能力的测定Transwell小室的下室内加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,上室加入含不同浓度5-Aza-CdR的细胞悬液,每组设3个滤膜。置于培养箱中,培养24h后,将小室取出,用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution,PBS)洗去培养液,结晶紫染色10min。用自来水将表面的结晶紫洗除干净,用棉签将上室中的细胞擦除干净。于倒置显微镜下(×200)对非细胞接种侧拍照,以穿膜细胞数的多少表示细胞侵袭能力的大小。4、A549细胞周期分布的测定肺腺癌A549细胞在6孔培养板中培养24h后,去除培养液。实验组分别加入含不同溶度1、5、10×10-6mol/15-Aza-CdR的培养液,对照组加入等量普通培养液。将培养板继续置于37℃、5%CO2的恒温闭式培养箱内培养,72h后回收细胞,以0.25%胰蛋白酶消化并收集于4℃离心机离心(1500r/min,5min),PBS液清洗3次,70%冰乙醇固定,用RNaseA(终浓度为0.1g/L)消化30min,加入0.05g/1碘化丙啶250μ l,采用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测A549细胞周期分布,室温避光染色30min后上机检测。以增殖指数(proliferation index, PI)衡量细胞分裂活动,PI=(S+G2/M)/(G0/G,+S+G2/M)。5、A549细胞TFPI-2甲基化状态的检测(1)细胞DNA提取：收集5-Aza-CdR处理72h后的A549细胞,按DNA提取试剂盒说明书提取组织DNA,再用紫外线分光光度仪检测DNA浓度。(2)重亚硫酸盐处理DNA：各取DNA2μg,使用DNA修饰试剂盒,进行亚硫酸氢盐修饰后,直接用于下一步实验。(3)甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specificpolymerize chain reaction, MSPCR)引物采用Primer Premier5.0生物软件设计。甲基化上游引物为：5’-TTTATGTTTTTAAGAGGTGGATTTC-3’,甲基化下游引物为：5’-AACTTTCTCCTATAATCCAAACGAA-3’,非甲基化上游引物为：5’-TTATGTTTTTAAGAGGTGGATTTTG.3’,非甲基化下游引物为：5’-CAAACTTTCTCCTATAATCCAAACAA-3’.PCR扩增：PCR反应总体系为25μl,PCR buffer2.0μl,2.5mmol/1dNTPMixture1.6μl,上游引物0.2μ下游引物0.2μ l,Taq酶0.1μl,修饰后DNA模板2.0μl,三蒸水13.9μl。反应条件：94℃,4min；94℃,30S；56℃,30S；72℃,45S；35个循环；72℃,5min。取5μl PCR产物,置入聚丙烯酰胺凝胶中,电泳40min,凝胶成像系统中成像。6、A549细胞的TFPI.2信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)表达的测定收集5-Aza-CdR处理72h后的A549细胞,用Trizol试剂提取各组细胞总RNA。用反转录酶和Oliga(dT)20引物合成cDNA,引物采用Primer Premier5.0生物软件设计。TFPI-2基因mRNA上游引物序列：5.TTCTCCGTTACTACTAC GACAGG-3’,下游引物序列：5.TCTATCCTCCAGCAAGCATCGT-3’.内标基因β-actin上游引物序：5.GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3’,下游引物序列：5-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’.反应体系均为25μl,PCR反应条件为：95℃预变性1min,94℃变性15s,58℃退火20s,72℃延伸20s,共进行40个循环,72℃延伸5min。溶解曲线：72℃→95℃,每20s升温1℃。结果处理：ΔCt=CtTFPI-2-Ctβ-actin,ΔΔCt=△Ct实验组-ΔCt对照组,相对mRNA表达倍数=2-ΔΔCt。实验重复三次,取均值。7、A549细胞的TFPI-2表达的测定5-Aza-CdR处理A549细胞72h后,收集各组细胞,加100μl RIPA裂解液。超声细胞破碎仪(400W)破碎5S,冰上裂解30min,然后-4℃.12000rpm离心5min。小心收集上清,Bradford法测定蛋白浓度。总蛋白沸水浴5min,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),蛋白质分离后经电转移槽移至PVDF膜。将转好的膜在室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶,封闭1h。稀释多克隆抗兔TFPI-2抗体,4℃过夜,然后在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min。将二抗用TBST稀释3000倍,室温下孵育30min后,用TBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min,加入化学发光剂显色。凝胶成像系统摄像,Alpha软件处理系统分析目标带的吸光度值,以β-actin为内参,采用TFPI-2吸光度值与β-actin吸光度值的比值作为TFPI-2蛋白的相对表达强度。实验重复三次,取均值。8、统计方法应用SPSS13.0统计软件分析,计量数据均以均数±标准差(χ±s)表示,采用Levene法进行方差齐性检验,若方差齐,数据采用方差分析(analysis of variance, ANOVA)检验,组间比较用LSD检验；若方差不齐,用Games-Howell法检验。结果：1、5-Aza-CdR对A549细胞增殖抑制率的影响5-Aza-CdR对A549细胞增殖的抑制作用呈一定的浓度和时间依赖性。当处理时间相同时,在一定的药物浓度内,A549细胞增殖抑制率随着5-Aza-CdR浓度的增加而逐渐增高,差异具有统计学意义(P<0.05)；当5-Aza-CdR浓度相同时,在一定的处理时间范围内,A549细胞增殖抑制率随着处理时间的延长也逐渐增高,差异也有统计学意义(P<0.05)。2、5-Aza-CdR对A549细胞的细胞周期分布情况的影响FCM检测显示,不同浓度的5-Aza-CdR处理A549细胞72h后,随着其浓度的增加,G0/G1期细胞数量逐渐增加,而S期细胞数量逐渐下降,细胞增殖指数也逐渐下降,差异有统计学意义(P<0.05)。3、5-Aza-CdR对A549细胞侵袭能力的影响Transwell小室模型检测A549细胞侵袭能力显示,1、5、10μM组,每一高倍镜下平均穿膜细胞数分别为84.15±12.14、28.85±7.13、14.35±3.33,与0μM组平均穿膜细胞数316.15±18.7相比较,实验组穿膜细胞数量明显下降,且与浓度相关(P<0.05)。4、5-Aza-CdR处理A549细胞后TFPI-2基因的甲基化状态MSPCR检测显示0μM组TFPI-2基因启动子呈高甲基化状态,1、5μM组TFPI-2基因都呈部分甲基化状态,10μM组TFPI-2基因呈非甲基化状态。实验结果提示5-Aza-CdR能通过去甲基化作用逆转TFPI-2基因启动子的高甲基化状态,并且这种作用随药物浓度的增加而增强。5.5-Aza-CdR处理A549细胞后TFPI-2基因mRNA的表达经5-Aza-CdR处理A549细胞72h后,与对照组相比,各实验组TFPI-2mRNA表达呈明显的上升趋势。0、1、5、10μM组的相对mRNA水平分别为1±0、1.49±0.14.1.86±0.09.5.80±0.15(P<0.05).6.5-Aza-CdR处理A549细胞后TFPI-2蛋白的表达Western、blot分析结果显示0μM组中TFPI-2蛋白的仅有极少量表达,而各实验组均有明显表达。β-actin在5-Aza-CdR作用前后并没有明显变化。0、1、5、10μM组的TFPI-2蛋白相对表达水平分别为0.12±0.01、0.23±0.02、0.31±0.02、0.62±0.03(P<0.05)。结论：1、5-Aza-CdR能逆转肺腺癌A549细胞TFPI-2基因的高甲基化状态,恢复TFPI-2基因的表达,并且这种去甲基化作用随5-Aza-CdR浓度的增加而增强。2、5-Aza-C(?)R明显抑制肺腺癌A549细胞的增殖及侵袭能力,并且随5-Aza-CdR浓度的增加而增强。这种抑制作用可能与TFPI-2基因表达的恢复有关。