烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是昆虫中枢神经系统中重要的神经递质受体,对于昆虫的正常生命活动至关重要。在农业害虫防治中,烟碱型乙酰胆碱受体是非常重要的杀虫剂靶标,新烟碱类、多杀菌素类、沙蚕毒素类和烟碱等多类杀虫剂或天然产物都作用于乙酰胆碱受体。昆虫乙酰胆碱受体的结构组成和药理学特性研究对于杀虫剂的创制开发,现有杀虫剂的合理使用以及害虫抗药性治理等农业生产活动具有非常重要的现实意义。体外重组乙酰胆碱受体是研究乙酰胆碱受体的结构极其功能的重要方法,但是在昆虫乙酰胆碱受体体外重组的研究中,虽然有很多在非洲爪蟾卵母细胞系统或其它细胞系表达系统中获得有功能受体的报道,但都限于单个亚基的同型受体(仅有配基结合实验证据)或有非昆虫乙酰胆碱受体亚基参与的杂合受体,完全使用昆虫的乙酰胆碱受体亚基获得有功能的重组受体一直没有取得成功。此前,人们一直认为是因为在昆虫体内除了α亚基和p亚基外还存在没有被发现的其它亚基类型,但随着果蝇等很多昆虫的基因组测序相继完成,人们认识到这种想法是错误的,因为昆虫体内就只有α亚基和β亚基两种类型。因此提出了昆虫乙酰胆碱受体的体外重组需要一个或数个附属蛋白的协助才能完成的假设。本文利用亲和层析和蛋白质谱等技术分离鉴定了东亚飞蝗乙酰胆碱受体的附属蛋白并通过非洲爪蟾卵母细胞表达系统和双电极电压钳电生理检测系统研究了其中一些附属蛋白对乙酰胆碱受体功能的影响,并试图寻找到关键的附属蛋白实现昆虫乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中的体外重组。一、乙酰胆碱受体附属蛋白的分离与鉴定活体解剖东亚飞蝗获得脑、神经节和腹神经索等神经组织并以其为实验材料,通过亲和层析技术、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相色谱及蛋白质谱技术相结合的方法对乙酰胆碱受体的附属蛋白进行了分离和鉴定。通过上述实验方法获得的蛋白数据经分析后,共鉴定1699个蛋白,在这些蛋白中有68个蛋白没有注释,有460个蛋白仅有编号或被注释为末知蛋白,如ACYPI000787和AGAP000325-PA等,这些蛋白大部分通过基因组数据预测其存在或通过同源性推断其存在。有明确注释的蛋白经整理后共有241种。从中发现了乙酰胆碱受体α亚基以及已经报道的在哺乳动物或其它动物中发现的能够和乙酰胆碱受体发生互作的蛋白。这为乙酰胆碱受体结构与功能的后续研究提供了极其重要的线索。二、乙酰胆碱受体附属蛋白基因的克隆及外源表达载体构建通过RT-PCR和RACE技术获得了东亚飞蝗钠钾泵5个亚基的基因,根据同源性分析结果分别将其命名为a1亚基(GenBank登录号KF813096)、α2亚基(KF813097)、β1亚基(KF813099)、p2亚基(KF813100)和p3亚基(KF813098)。其中α亚基都具有ATP磷酸化位点,去磷酸化的功能域和hinge保守序列等钠钾泵α亚基特征,p亚基都具有保守的半胱氨酸环及糖基化位点等钠钾泵p亚基特征。应用同样的基因克隆方法获得了bh-04的基因。将上述克隆获得的基因构建到外源表达载体pGH19中,为后续附属蛋白功能研究奠定基础。三、钠钾泵对乙酰胆碱受体功能影响研究钠钾泵是跨膜转运蛋白复合体,分布在细胞膜上,通过消耗能量进行细胞内与细胞外环境间钠离子和钾离子的转运,维持细胞电势。近来的研究表明钠钾泵除了转运阳离子的功能外,还具有细胞信号转导等功能。在线虫中的研究表明钠钾泵能够调节乙酰胆碱受体在神经肌肉接头处的分布情况,在骨骼肌细胞中的研究显示,乙酰胆碱受体可以通过调节钠钾泵引起细胞电发生(electrogenesis)特性的改变,这些都表明钠钾泵对乙酰胆碱受体的功能有重要影响。本章利用已构建的东亚飞蝗钠钾泵α1和p1亚基以及东亚飞蝗乙酰胆碱受体的α1亚基和大鼠的β2亚基的质粒,通过非洲爪蟾卵母细胞表达系统和电生理实验研究了钠钾泵对乙酰胆碱受体功能的影响。研究结果表明受到激动剂刺激的乙酰胆碱受体能够显著增加钠钾泵在不同电压下的反应电流,而钠钾泵可以显著增加乙酰胆碱受体对激动剂的敏感性,而且钠钾泵对乙酰胆碱受体的影响独立于其离子泵功能。四、乙酰胆碱受体基本功能单位的体外重组目前,体外重组昆虫乙酰胆碱受体必须借助哺乳动物的p亚基才能完成,因而人们推测完全使用昆虫的乙酰胆碱受体亚基获得体外重组受体需要一个或数个关键的附属蛋白的协助才能完成。已有的研究表明RIC-3和Lynx等附属蛋白对乙酰胆碱受体的功能有很大影响,但它们并不能协助获得只由昆虫亚基组成的重组受体。本章将已经鉴定获得的附属蛋白bh-04(结果正准备发表,暂时由编号代替)同昆虫α1亚基和p1亚基共同在非洲爪蟾卵母细胞中表达,通过双电极电压钳电生理系统研究了蛋白bh-04对乙酰胆碱受体组成与功能的影响。单独表达乙酰胆碱受体的α1亚基和β1亚基或bh-04蛋白对乙酰胆碱受体激动剂都不能产生反应电流,但同时表达乙酰胆碱受体的α1亚基和β1亚基以及bh-04蛋白出现电流反应,并且该电流可以被乙酰胆碱受体的特异拮抗剂阻断。结果表明,通过bh-04蛋白的协助获得了只由昆虫乙酰胆碱受体亚基组成的体外重组受体。另外,我们利用获得的昆虫乙酰胆碱受体重新评价了导致昆虫对吡虫啉产生靶标抗性的乙酰胆碱受体α亚基Y151S突变的影响。