鞘蕊苏药材的植物名为毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii(Willd.)Briq.)系唇形科(Labiatae)鞘蕊花属(Coleus Lour.)植物,主产于印度、尼泊尔、巴基斯坦、斯里兰卡、缅甸、泰国等南亚国家;我国云南、福建、台湾等地亦有分布,被植物学家界定为珍稀植物。民间将该药材用于治疗哮喘、咳嗽等疾患,疗效显著,称为“神药”。现代科学研究表明,鞘蕊苏的有效成分半日花烷型二萜类化合物,我国产鞘蕊苏的有效成分为异佛司可林(isoforskolin),并将其定为指标性成分。鉴于鞘蕊苏独特药效作用,本实验室与湖北福人药业股份有限公司实施产学研结合,以鞘蕊苏为君药,配伍前胡、甘草组方,将其开发为“鞘蕊苏胶囊”中药新品种,获得生产批号(批件号:2011S00365)。为了解决鞘蕊苏胶囊产业化所需原料药材的供求问题,实验室与湖北福人药业股份有限公司合作,从云南会泽县引种鞘蕊苏至湖北通城县规范化种植。针对通城种植鞘蕊苏药材的主要二萜类成分isoforskolin含量偏低的问题,本论文对该药用植物二萜类成分的生物合成机制进行了研究,以期为通城种植鞘蕊苏培育优良种质;并进行了紫外线照射采收的鞘蕊苏药材,诱导其主要有效成分isoforskolin增加的生物合成机制研究,以期为促进种植鞘蕊苏主要有效成分的生物合成和积累提供科学依据,并为通过遗传改良手段培育鞘蕊苏优良种质提供基础,也为二萜化合物的代谢机制的深入研究提供重要信息。本研究的主要研究结果如下:1.基于Illumina HiSeq高通量测序的鞘蕊苏转录组分析以通城县种植基地的鞘蕊苏为试验材料,于10月下旬采集该药材的叶和根作为供试品,采用HiSeq技术进行转录组测序,获得36Gb转录组数据,拼接后得到422,761条高质量序列;对组装的Unigene基因进行预测,获得CDS序列和Protein序列;采用Trinity和TGICL的方法从头组装、序列拼接和去冗余处理,得到291,061个Unigene基因,平均长度629bp;将所得Unigene基因与Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG公共蛋白数据库进行比对,140,228(48.19%)的unigene基因能够获得注释信息。将140,228个注释信息的unigene基因进行go和cog聚类分析及kegg代谢通路分析,86,578条unigene基因获得cog功能注释,被归类为25个功能分类;共有186,957条unigene基因获得go功能注释,被归入到49个go次级功能分类;共有6,616个unigene可以分配到261个代谢通路。因此,本项研究为鞘蕊苏有效成分的萜类合成酶基因克隆,序列分析及表达研究奠定了基础,并且根与叶中23个萜类差异基因则为传统育种和转基因育种的基因调控靶点提供了研究基础。2.基于高通量测序的鞘蕊苏萜类合成酶基因克隆、序列分析及表达研究在上述高通量基因测序研究基础上,从注释信息数据中挑选基因片段,采用race技术进行序列分析,获得三个萜类合成酶的全长cdna序列,并通过blast和蛋白序列分析。结果如下:(1)cfgcs基因全长2059bp,包含235bp的5’非编码区,1632bp的开放式阅读框(orf),192bp的3’非编码区,编码544个氨基酸;对蛋白理化性质进行预测,cfgcs相对分子质量为63690.84;等电点为5.23;分子式为c2868h4438n738o848s27。qpcr表明cfgcs在鞘蕊苏叶的表达量较高。(2)cfvps基因全长1874bp,包含116bp的5’非编码区,1647bp的orf,111bp的3’非编码区;cfvps相对分子质量为63608.40,等电点为5.06,分子式为c2859h4412n744o852s24。以cfvps为目标基因,构建表达载体pet28-cfvps,将构建好的表达载体于大肠杆菌中进行原核表达,32℃时诱导6h,菌液上清中有大量表达。cfvps参与植物单萜化合物合成,而鞘蕊苏叶片表面有丰富的腺毛分布,是单萜合成的主要场所,qpcr结果也表明cfvps在叶中的表达量最高。(3)cfgas基因全长1234bp,包含72bp的5’非编码区,993bp的orf,169bp的3’非编码区;cfgas相对分子质量为36895.20,等电点为6.37,分子式为c1672h2575n437o482s12。与山茶花、丹参、番薯零、大麻、烟草、碧冬茄、节节麦、小麦进行同源性比较,发现cfcps蛋白与丹参GA蛋白的亲缘关系比较近。同时通过Gateway的方法进行GAS过量表达重组载体构建,为后续发根农杆菌侵染提供实验基础。qPCR结果表明CfGAS参与赤霉素的合成,赤霉素是二萜类植物激素,在植物的整个生长过程中发挥着重要作用,在鞘蕊苏各个组织中均有分布。3.紫外线照射提高鞘蕊苏药材有效成分含量的分子机制研究本实验前期研究表明,通过紫外线照射鞘蕊苏药材能提高其二萜类有效成分的含量。基于上述鞘蕊苏高通量转录组研究所获萜类生物合成酶关键基因的启示,本论文进行了紫外线照射诱导鞘蕊苏二萜类成分生物合成机制研究。研究结果表明,紫外线照射能够有效提高鞘蕊苏药材根部isoforskolin含量,提高幅度高达53%。通过q PCR检测紫外照射鞘蕊苏后萜类生物基因表达水平,表明TPS1、TPS2、TPS3、TPS4、TPS14表达量明显受紫外线的诱导而升高,而TPS15、赤霉素合成酶和贝壳杉烯合成酶受紫外线诱导而降低。本研究为提高种植鞘蕊苏药材有效成分含量提供了科学依据,并为提高规范化种植中药材的资源品质探索了新途径。