银屑病是一种以角质形成细胞过度增殖为特征，由T细胞介导的免疫异常性疾病。银屑病病程长、容易反复发作、不易痊愈，发病过程又伴随大量脱屑，给患者带来巨大的心理和生理危害。　　 银屑病临床上分为寻常型、关节病型、红皮病型和脓疱型。最常见的寻常型银屑病治疗以外用药物为主。目前外用药物种类繁多，效果也因人而异。维生素D衍生物是目前治疗银屑病的常用药物，也是受广大皮肤科医生喜爱的一种外用药物。随着时间的推移，维生素D衍生物在临床得到广泛应用，问题也随之产生了。有研究发现大约15％的银屑病患者使用维生素D衍生物后产生了皮炎，而大多数患者在治疗半年到一年后，对维生素D衍生物产生了耐药性。耐药性是不容忽视的问题，基于这方面原因，我们有必要寻找一种安全、有效的局部治疗银屑病的新方法。当患者一旦出现耐药性时可以作为接替治疗方案对患者继续予外用药物治疗，以减少系统用药产生的副作用。　　 甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)因为具有同维生素D衍生物相似的作用特性，映入人们的视野。甲状旁腺素是由甲状旁腺主细胞分泌的含84个氨基酸的单链多肽，相对分子量为4117.7，分子式为C181H291N55O51S2。甲状旁腺素相关肽(parathyroid related peptide，PTHrP)与PTH具有相似的生物学活性，它最初是从恶性肿瘤致体液性高钙血症(humoral hypercalcemia of malignancy，HHM)患者的血浆中发现的，目前已知PTHrP是引起HHM的体液因素之一。重组人甲状旁腺素(1-34)[recombinant human parathyroid hormone，rhPTH(1-34)]是人工合成的PTH N-端的1到34个氨基酸组成的多肽，虽然人们对rhPTH(1-34)的作用机制尚不完全清楚，但有证据显示rhPTH(1-34)对表皮细胞的增殖和分化起到重要作用。　　 PTH通过与PTH受体结合发挥调节表皮角质形成细胞正常生理功能，维持表皮正常结构的作用。在人体内，当角质形成细胞停止增殖并从基底膜向上层移动后，角质形成细胞开始实施对PTH的调节作用。具体情况为，来自上层的PTHrP下降告诉基底层细胞上层细胞的数量情况，以此控制细胞的增殖率。当上层细胞数量较多时，下降的PTHrP减少，基底层细胞的增殖就减少；当上层细胞少时，下降的PTHrP就增多，基底细胞的增殖就增加。当角质形成细胞表达PTHrP出现错误时，就会出现病态。银屑病患者皮损因为不能正常表达PTHrP，使控制角质形成细胞增殖和分化的机制失调，所以表现为银屑病样皮损。因此国外研究认为角质形成细胞的增殖与分化是由PTHrP和Ca2+调控的。同时有实验显示rhPTH(1-34)在人体内、外都有抑制表皮角质形成细胞增殖，诱导细胞终末分化的潜能。在这一点上，rhPTH(1-34)与维生素D衍生物表现出相似的特性。　　 于是国外有研究者提出利用PTH(1-34)治疗银屑病等增殖性皮肤病的想法。据报道小样本临床实验研究取得了满意的效果。银屑病患者外用PTH(1-34)药物治疗后，皮损处的红斑、鳞屑、浸润明显减轻，并且没有出现高血钙、高尿钙等明显副作用。皮肤病理显示表皮的增厚与淋巴细胞浸润也明显下降。　　 既然PTH(1-34)有如此强大的功能，那么我们设想是否可以将PTH(1-34)开发为一种治疗银屑病的新型外用药。关于这方面的研究国内开展的很少，我科在国内首次将rhPTH(1-34)作用于人角质形成细胞(HaCaT细胞)，弥补了这一空白，而且前期工作已取得较为满意的科研成果。在前期工作中，我科同事将rhPTH(1-34)乳膏外用于银屑病样小鼠模型，结果显示乳膏具有显著抑制阴道上皮细胞有丝分裂、促进表皮颗粒层生成的作用。　　 银屑病的致病环节错综复杂，致病因子之间彼此联系形成巨大网络，那么rhPTH(1-34)是通过怎样的途径发挥作用，药物作用的靶基因与靶蛋白是哪些呢?为进一步深入探讨这些问题我们开展了此次实验。整个实验中我们运用MTT法、流式细胞仪检测rhPTH(1-34)作用后细胞的增殖变化情况。用实时定量PCR法(real timequantitative PCR)、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测rhPTH(1-34)作用后，细胞分泌CXCL11/I-TAC的变化情况，分析药物与Th1细胞占主导的银屑病免疫反应的关系。运用基因芯片、蛋白质芯片等技术分析rhPTH(1-34)是否通过影响Hedgehog信号通路、酪氨酸激酶的表达来调节细胞的生理状态，并筛选rhPTH(1-34)作用的差异基因和差异蛋白，为进一步开发此药奠定理论基础。　　 第一部分rhPTH(1-34)对HaCaT细胞增殖及分泌CXCL11/I-TAC的影响　　 目的：研究rhPTH(1-34)对人角质形成细胞HaCaT细胞株在细胞增殖、分泌CXCL11/I-TAC方面的影响。　　 方法：用不同浓度的rhPTH(1-34)(1×10-11mol/L～5×10-5mol/L)刺激HaCaT细胞，用MTT法检测不同浓度rhPTH(1-34)作用后HaCaT细胞的增殖情况。实验分为rhPTH(1-34)组和空白对照组，用流式细胞仪检测rhPTH(1-34)作用后，细胞周期及细胞凋亡的变化情况。将rhPTH(1-34)分别作用HaCaT细胞24h、36h、48h，用实时定量PCR反应检测HaCaT细胞表达CXCL11/I-TAC mRNA的情况。先用Tumor necrosisfactor-α(TNF-α)诱导HaCaT细胞，再分别用3.125×10-6mol/L、1.25×10-5mol/L、5×10-5mol/L浓度的rhPTH(1-34)作用HaCaT细胞。24h后用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HaCaT细胞分泌CXCL11/I-TAC的情况。　　 结论：rhPTH(1-34)有抑制HaCaT细胞增殖的作用；rhPTH(1-34)对Th1占主导的银屑病的治疗机制可能与其抑制角质形成细胞分泌CXCL11/I-TAC有关。因此推断rhPTH(1-34)对银屑病可能有一定的治疗效果。rhPTH(1-34)对银屑病的治疗机制，可能与其抑制角质形成细胞分泌CXCL11/I-TAC有关，从而逆转了角质形成细胞的增殖，也减轻了炎性反应。　　 第二部分rhPTH(1-34)对HaCaT细胞Hedgehog信号通路的影响　　 目的：通过rhPTH(1-34)作用HaCaT细胞后，细胞内Hedgehog信号通路基因表达谱的比较，探讨rhPTH(1-34)对HaCaT细胞内Hedgehog信号通路的影响；同时筛查rhPTH(1-34)调节HaCaT细胞的相关靶基因，并分析其可能的作用机制。　　 方法：实验分为rhPTH(1-34)组和空白对照组，两组均按基因芯片的常规操作步骤，经过RNA抽提、DNaseI消化RNA样品、RNA纯化、RNA质量检测、cDNA合成、实时定量PCR、数据分析等，检测两组标本HaCaT细胞的Hedgehog信号通路基因表达的差异性。　　 结论：本实验的基因芯片结果显示rhPTH(1-34)对HaCaT细胞的调节作用可能与Hedgehog信号通路中的PTCHD1、BMP4、SMO有关。rhPTH(1-34)作用HaCaT细胞后，细胞Hedgehog信号通路发生了变化，最终起到抑制角质形成细胞增殖的作用。　　 第三部分rhPTH(1-34)对HaCaT细胞表达酪氨酸激酶的影响　　 目的：通过rhPTH(1-34)作用HaCaT细胞后，细胞内属于酪氨酸激酶的156种蛋白质进行差异性比较，探讨rhPTH(1-34)是否通过调节HaCaT细胞酪氨酸激酶的表达从而起到治疗银屑病的作用。同时筛查rhPTH(1-34)作用HaCaT细胞的相关效应靶蛋白，为rhPTH(1-34)治疗银屑病提供理论依据。　　 方法：实验分为rhPTH(1-34)组和空白对照组，两组分别应用蛋白芯片技术，经过蛋白质提取、BCA蛋白质定量、酪氨酸磷酸化抗体检测、图象和数据采集、将同组实验的芯片的数据进行汇总及比较，筛选出差异蛋白。最后对差异蛋白进行分析，找出可能与银屑病相关的效应靶蛋白。　　 结论：rhPTH(1-34)对HaCaT细胞的调节作用可能与酪氨酸激酶有关。rhPTH(1-34)通过抑制HaCaT细胞酪氨酸激酶的表达，抑制细胞增殖，减轻炎症细胞浸润，进而起到治疗银屑病的作用。