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背景与目的化疗是临床治疗结肠癌的常用疗法,但是长期化疗引起的药物敏感性降低是影响肿瘤化疗效果及预后的重要因素。肿瘤细胞可以通过多种不同途径产生耐药,目前的研究主要关注于P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、热休克蛋白、肺耐药相关蛋白等。近来神经酰胺在多药耐药形成中的作用逐渐引起了学者的注意。葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)是葡萄糖转移酶的一种,它可以是神经酰胺糖基化为GlcCer,逃避神经酰胺介导的凋亡作用减少细胞凋亡,因此产生耐药。不少文献报道GCS与乳腺癌、胃癌和黑色素瘤等细胞耐药的产生有关,但其在结肠癌细胞耐药形成中的作用目前研究的并不多。因此我们进行本研究,通过RNA干扰沉默HCT-8/V的葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)研究其耐药机制。本研究首先在结肠癌耐药细胞系HCT-8/V中转染UGCG shRNA Plasmid(h)(靶向沉默GCS基因的载体),然后筛选建立稳定的细胞系,采用RT-PCR和Western Blot检测其沉默效果,应用CCK-8检测其生长曲线和药物敏感性的变化,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,并进一步研究其机制。本课题从基因、蛋白等方面研究GCS与结肠癌耐药产生的关系,并运用RNA干扰技术观察能否逆转结肠癌的化疗耐药,为临床克服结肠癌化疗耐药,提供一定的理论方向。方法1HCT-8细胞培养于含1O%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,常规传代培养。而HCT-8/VCR细胞培养液中加入长春新碱(vincristine, VCR)2ug/ml,以维持其相应的耐药表型。开始测定前撤药,进行无药培养2周。2UGCG shRNA Plasmid转染HCT-8/VCR细胞,100μ9/ml嘌呤霉素的培养基进行筛选,建立转染后稳定传代细胞系。3用细胞活性(Cell Counting kit-8, CCK-8)法检测转染前后生长曲线和药物敏感性的变化。4用RT-PCR和Western Blot检测其沉默效果,并进一步研究GCS蛋白的表达和P-gp及Caspase-3蛋白的关系。5用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果1CCK8检测显示与转染前比较,转染UGCG shRNA Plasmid后细胞的生长曲线基本相似,没有明显差异；而顺铂(DDP)IC50降低,敏感性增高。2RT-PCR和Western blot结果显示转染UGCG shRNA Plasmid后细胞的GCSmRNA和蛋白的相对含量明显减少(p<0.05),表明达到了沉默效果,降低了GCS的表达。3RT-PCR和Western blot结果显示转染UGCG shRNA Plasmid后细胞多药耐药基因(MDR1)的表达量减少了(p<0.05)；RT-PCR和免疫组化结果显示,在没有化疗药物处理的情况下,凋亡基因(Caspase-3)基因表达量也减少了(p<0.05)。4流式细胞结果也显示,在没有化疗药物处理的情况下,转染后细胞的凋亡率下降了(p<0.05)。结论UGCG shRNA Plasmid可以抑制GCS基因的表达,且转染后细胞对化疗药物的敏感性明显增高,这意味着GCS基因沉默可以有效逆转肿瘤细胞的耐药现象。