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单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种人畜共患革兰氏阳性菌,也是一种食源性微生物。它通过被污染的食物从消化道进入人体,能穿越肠道屏障进入血液或者作用于相应的靶器官。作为一种胞内寄生菌,单增李斯特菌有多个关键毒力因子参与感染细胞的过程,磷脂酶PlcB作为重要毒力蛋白之一,在李斯特菌感染和吞噬体逃逸中发挥着至关重要作用,但其是否具备类似LLO操纵宿主相关生物学过程的功能至今尚未明晰。基于此点,本研究通过酵母双杂交、蛋白互作定位、激光共聚焦等细胞生物学、分子生物学方法,筛选与毒力因子PlcB相互作用的宿主蛋白,通过探究磷脂酶PlcB与宿主蛋白相互作用的分子机制,从而为进一步深入了解李斯特菌逃逸宿主天然免疫的机制奠定基础。1.诱饵载体pGBKT7-PlcB的构建及毒性和自激活检测在酵母双杂交试验中,首先构建诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB,结果显示1%的琼脂糖凝胶上有清晰明亮的条带,与预期的795 bp目的条带相符,且与阳性对照条带的大小一致,以上结果表明成功构建诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB;诱饵质粒构建完毕后,进行了对酵母细胞的自激活检测,结果显示含诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB酵母菌株和含pGBKT7空载体在SDO/X-α-Gal培养基中均能生长且菌落不变蓝色,在SDO/X-α-Gal/Aba培养基中均不长菌,结果表明该诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB未在酵母中发生自激活;之后进行了对酵母细胞的毒性检测,结果显示含有pGBKT7-BD-PlcB和pGBKT7的酵母能在SDO培养基中正常生长且菌落数量及大小均无明显差异,表明该诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB在酵母中无毒性;最后进行了诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB的蛋白表达检测,结果显示含有诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB的酵母菌株所表达的蛋白条带符合预期蛋白大小51.3 k Da且阳性对照条带清晰,空白和阴性对照无条带,表明诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB在酵母中能正常进行蛋白表达。2.酵母双杂交筛选与磷脂酶PlcB相互作用的宿主蛋白本章节首先检测了人cDNA文库的质量,结果显示该人cDNA文库的滴度为3.73×10~8 CFU/m L,表明该文库符合作为酵母双杂交文库的标准;接下来将上述构建成功的诱饵质粒pGBKT7-BD-PlcB与人cDNA文库进行杂交,通过严格缺陷培养基的第一轮筛选,DDO/X固体培养基一共长出348个蓝色克隆子。通过第二、三轮筛选,在QDO/X/A固体培养基长出蓝色阳性克隆子341个,将其进行测序比对获得4个候选阳性克隆;在进行诱饵质粒和候选阳性质粒的回补验证中,结果显示4个候选阳性克隆均回补验证成功,表明通过酵母双杂交试验,一共筛选出4种宿主蛋白与磷脂酶PlcB能发生相互作用。3.PlcB与线粒体内膜蛋白Mic60的互作机制研究通过同源重组的方法,构建全长的PlcB和Mic60重组质粒,结果显示在菌落PCR试验中在1%的琼脂糖凝胶上泳道上有清晰明亮的条带,其大小与预期的795 bp和1395 bp目的条带相符,即重组质粒p CMV-Myc-PlcB、p CMV-HA-Mic60构建成功;在免疫共沉淀试验中,Input样品中外源Mic60和PlcB蛋白以及β-Tubulin内参蛋白表达正常,IP样品中外源Mic60有条带出现且对照组IgG无条带,结果表明外源Mic60和PlcB蛋白能在体外发生直接的相互作用;在间接免疫荧光试验中,外源Mic60显示出绿色荧光以及PlcB蛋白显示出红色荧光,且两个光源相互重叠在一起,结果表明外源Mic60和PlcB蛋白在胞内共定位。接下来截取磷脂酶PlcB和Mic60的关键结构域,通过免疫共沉淀试验,结果表明磷脂酶PlcB存在多个关键结构域与线粒体内膜蛋白Mic60相互作用,Mic60存在多个关键结构域与PlcB相互作用,其中Mic60(187-296aa)不能与PlcB发生相互作用。综上所述,本研究通过酵母双杂交和免疫共沉淀等方法首次筛选并确定了李斯特菌毒力蛋白PlcB能够与Mic60互作;磷脂酶PlcB存在多个关键结构域与线粒体内膜蛋白Mic60相互作用,Mic60存在多个关键结构域与PlcB相互作用,其中Mic60(187-296aa)不能与PlcB发生相互作用。这为进一步深入阐明PlcB在李斯特菌感染调控线粒体结构变化过程中发挥的功能和分子基础提供了关键线索。