【摘 要】
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来源于甜叶菊叶片的天然甜味剂中,与目前较为流行的甜菊糖苷（Stevioside,ST）、莱鲍迪苷A（Rebaudioside A,RA）、莱鲍迪苷D（Rebaudioside D,RD）相比,莱鲍迪苷M（Rebaudioside M,RM）具有热量较低、甜度更高、口感纯净的优点,但其在甜叶菊叶片中的含量极低（少于1%）,且提取工艺繁琐,污染严重,成本较高,不适合大规模生产。而酶法合成RM则是一种绿
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来源于甜叶菊叶片的天然甜味剂中,与目前较为流行的甜菊糖苷（Stevioside,ST）、莱鲍迪苷A（Rebaudioside A,RA）、莱鲍迪苷D（Rebaudioside D,RD）相比,莱鲍迪苷M（Rebaudioside M,RM）具有热量较低、甜度更高、口感纯净的优点,但其在甜叶菊叶片中的含量极低（少于1%）,且提取工艺繁琐,污染严重,成本较高,不适合大规模生产。而酶法合成RM则是一种绿色环保的制造工业过程,但该方法存在糖基转移酶催化效率低和需要添加昂贵的UDPG底物等缺点。本论文研究了RM合成途径中的糖基转移酶UGT76G1和EUGT11以及蔗糖合成酶SUS1在不同宿主中的表达活性,并构建体外多酶级联反应体系催化合成RM工艺途径,优化糖基转移酶UGT76G1和EUGT11催化效率以及蔗糖合成酶SUS1循环再生底物途径,提高级联反应体系终产物RM的产量,主要研究内容如下:（1）在四种宿主（黑曲霉,解脂耶氏酵母,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）中表达糖基转移酶UGT76G1、糖基转移酶EUGT11和蔗糖合成酶SUS1,筛选出适合糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组蛋白表达系统。糖基转移酶UGT76G1和EUGT11,蔗糖合成酶SUS1在解脂耶氏酵母和大肠杆菌表达系统中均获得较高的表达酶活。解脂耶氏酵母重组表达的UGT76G1以ST为底物时,酶活为29.71 U/g,以RD为底物时,酶活为24.28 U/g;解脂耶氏酵母重组表达的EUGT11酶活为7.65 U/g;解脂耶氏酵母重组表达的SUS1酶活为56.34 U/g;大肠杆菌重组表达的UGT76G1以ST为底物时,酶活为31.35 U/g,以RD为底物时,酶活为19.27 U/g;大肠杆菌重组表达的EUGT11酶活为5.09 U/g;大肠杆菌重组表达的SUS1酶活为65.34 U/g。（2）在与蔗糖合成酶SUS1构成的体外单级联反应系统中,通过测定解脂耶氏酵母和大肠杆菌中所表达的糖基转移酶UGT76G1和EUGT11对糖苷类底物的转化率,比较探究参与体外多酶级联反应体系的各重组酶表达活性。其中,糖基转移酶EUGT11对RA的底物转化率较低,解脂耶氏酵母胞内重组表达的EUGT11对RA的转化率为19.67%,大肠杆菌胞内重组表达的EUGT11对RA的转化率为13.25%,且在两个表达系统中EUGT11的表达酶活力也较低。由底物转化率和酶活数据比较可知,参与体外多酶级联反应体系的各重组酶中,糖基转移酶EUGT11的表达活性较差。（3）为提高糖基转移酶EUGT11的表达活性从而提升级联体系终产物RM的产量,在大肠杆菌中,利用串联启动子的方法提升该酶表达量,比较发现三重启动子启动转录时该酶活力达到10.84 U/g,是单重启动子启动转录时的2.13倍。利用表达优化后的重组大肠杆菌粗酶液建立体外多酶级联反应体系,RM产量达到3.79 m M,是优化前的2.35倍。（4）为提高体外级联体系终产物RM的产量,在解脂耶氏酵母表达系统中,利用含有zeta序列的多拷贝自整合表达载体,增加关键糖基转移酶UGT76G1和EUGT11基因在解脂耶氏酵母基因组中的拷贝数提升表达量和酶活。用优化表达后的重组解脂耶氏酵母胞内蛋白提取液建立体外多酶级联反应体系,RM产量达到6.71 m M,较优化前提升了40.38%。为构建体外多酶级联反应体系催化合成RM,本论文将糖基转移酶UGT76G1,糖基转移酶EUGT11和蔗糖合成酶SUS1于黑曲霉,解脂耶氏酵母,枯草芽孢杆菌,大肠杆菌中重组表达,通过对各重组酶的表达活性进行比较研究,筛选得到糖基转移酶UGT76G1,糖基转移酶EUGT11和蔗糖合成酶SUS1适合的重组表达系统为解脂耶氏酵母和大肠杆菌。并利用解脂耶氏酵母和大肠杆菌表达的重组酶分别建立两个体外多酶级联反应体系催化合成RM,通过利用多重启动子和增加基因拷贝数的方法进行关键酶的表达优化以提升酶活,从而达到提升RM产量的作用,解脂耶氏酵母重组酶构建的体外多酶级联反应体系RM产率达到67.14%,较大肠杆菌重组酶体系的RM产率高出77.04%,为工业合成RM提供理论和数据支撑。
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