目的：1、以不同极性的中药多组分药物为研究对象,以丹参酮IIA(TSN)、丹酚酸B(SalB)以及甘草次酸(GA)复方脂质体(GTS-lip)的包封率、表观形态、Zeta电位、粒径及其分布等质量评价参数为指标,探索三组分同时被包封于脂质体的制备工艺,考察本给药系统构建的合理性。2、以GTS-lip体外释药行为及细胞药效、动物体内药代动力学及组织分布为研究内容,考察丹参-甘草不同极性组分复方脂质体配方的合理性,并为探讨构建评价该脂质体方法的可行性提供实验依据。方法：本课题共包含四部分内容。第一部分,GTS-lip处方前研究。建立TSN、Sal B、GA同时测定HPLC方法,并对方法学进行验证；考察水溶性药物Sal B在不同pH条件下的油水分配系数；恒温震荡法测定2个脂溶性药物TSN和GA在PBS (pH=6.8)缓冲液、0.2%吐温、0.5%吐温、0.2%SDS、0.5%SDS中的平衡溶解度；分别建立脂溶性成分、水溶性成分的包封率测定方法,考察葡聚糖凝胶过滤法、低速离心法测定GTS-lip中2个脂溶性成分包封率的最优条件,以回收率为指标考察2种方法的准确性；考察高速离心法、高速离心-超滤法对水溶性成分SalB包封率的测定,对最优方法进行优化和验证。第二部分,GTS-lip的制备及其药剂学性质研究。分两步优化GTS-lip工艺,首先制备2个脂溶性成分的复方脂质体GT-lip,以包封率和粒径为指标筛选薄膜分散法、乙醇注入法、逆向薄膜分散法3种制备方法；以TSN、GA包封率为双指标,进行单因素考察,包括磷脂类型、SPC与CH比例、SPC与TSN比例、SPC与GA比例、水合温度、探头超声功率等,并在此基础上进行正交优化筛选最优工艺。进一步,在GT-lip的基础上,以三种药物包封率、粒径为指标筛选Sal B最佳载入方法,并逐一对缓冲液pH、孵育时间、孵育温度、SPC与Sal B比例、SPC与GA比例等影响其载入的主要因素进行单因素考察,同时研究丹酚酸B的载入对丹参酮ⅡA、甘草次酸包封率的影响；在单因素基础上,以Sal B和TSN包封率为指标,采用Box-Behnken法筛选Sal B最优载入工艺,并进一步考察脂质体的冻干工艺；两步制备过程中,均对脂质体外观、粒径、电位等进行监测。最终分别采用反透析法和透析法考察脂质体中脂溶性成分和水溶性成分的体外释药情况并进行相关方程拟合。第三部分,GTS-lip对肝星状细胞的增殖抑制研究。考察GTS-lip对肝纤维化发病的中心环节-肝星状细胞(HSC)增殖的抑制作用。以HSC增殖抑制率为指标,考察不同给药剂量和不同作用时间点GTS-lip的细胞药效,并与TSN、GA、Sal B物理混合溶液组比较,电镜监控细胞形态。第四部分,GTS-lip小鼠体内药代动力学与组织分布研究。建立小鼠血浆及心、肝、脾、肺、肾、脑各组织匀浆的前处理方法和Sal B.TSN.GA同时测定的UPLC-PDA检测方法,并对各方法学进行验证；小鼠尾静脉给药,于0.083、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6h取血和各脏器,测定相应药物浓度,采用WinNonlin5.2药代动力学软件对各时间点血浆及各组织中三个药物的浓度进行处理,分别计算药动学参数,绘制三个药物的血浆药物浓度-时间曲线和各组织分布条形图,并与普通混合溶液组对应药物进行对比,考察药物载入脂质体后药动学参数的变化及在血液及各组织中分布行为的改变。进一步,以肝脏相对摄取率Re和峰浓度之比Ce为指标,评价脂质体中三个药物的肝靶向性。结果：第一部分,建立同时测定Sal B.TSN.GA的HPLC方法,结果表明：Sal B在60～600μg·mL-1高浓度范围、8～120pg·mL-1低浓度范围,TSN在16～400μg·mL-1高浓度范围、0.4～30μg·mL-1低浓度范围,GA在30～600μg·mL-1高浓度范围、0.4～30μg·mL-1低浓度范围,均呈良好线性关系。加样回收率、精密度、稳定性均符合要求,证明该方法准确、灵敏。油水分配系数结果表明,酸性条件下Sal B的表观油水分配系数随pH降低有增大的趋势,pH=3.32时,Sal B体现一定的亲脂性。溶解度测定结果表明TSN和GA在PBS中溶解度均较低,属于难溶性药物。加入一定量表面活性剂后,溶解度有一定程度改善,其中0.5%SDS对二者增溶效果较明显。脂溶性药物包封率方法考察结果发现葡聚糖凝胶G-50(M)对脂质体有一定吸附,不适合GT-Lip包封率的测定,采用2000 r·min-1,离心5 min的低速离心法能使GT-Lip脂质体与游离药物有效分离,水溶性药物包封率测定选用高速离心.超滤法,该方法准确、方便、快捷。第二部分,第一步GT-lip处方和工艺优化部分最终选用天然大豆磷脂和胆固醇为膜材,薄膜分散法为制备方法,正交试验确定最优处方为SPC-CH质量比为6:1,SPC-TSN物质的量之比为30:1,SPC-GA物质的量之比为24：1。第二步将Sal B载入GT-lip选用主动载药法,Box-Behnken优化得到理论最优处方为：甘草次酸与磷脂质量比=0.08,丹酚酸B与磷脂质量比=0.12,缓冲液pH=3.3,最终制备得GTS-lip中Sal B.TSN.GA包封率分别为96.03+0.28%,80.63±0.91%,88.56±0.17%,粒径n=191.3±6.31 nm, Zata=11.6±0.35 mv,总体载药量为(13.48±0.69)%。冻干条件筛选结果显示选用9%蔗糖作为冻干保护剂对GTS一lip的冻干保护效果较好,可有效提高脂质体的稳定性,该冻干条件下脂质体复溶后分布均匀、粒度圆整,包封率较冻干前变化不大。体外释药结果表明GTS—lip中三个药物均体现出一定的缓释效果,且均符合Hixon-crowell方程模型。第三部分,体外细胞药效结果表明在一定浓度范围内,GTS-lip具有明显的HSC增殖抑制作用,该作用在24h处与脂质体给药浓度呈现一定的剂量依赖关系。与Mix组相比,脂质体组C1和C2两个浓度组48h抑制作用较同组24h分别提升了2.3倍和1.9倍。而Mix组24h和48h抑制作用变化不大,提示该现象可能与GTS-lip的缓释作用有关。第四部分,血浆和各组织匀浆样品均采用乙酸乙酯2次萃取法结合UPLC-PDA检测,能准确提取各样品中三个药物,并在5min之内出峰,该方法准确、快捷、高效。静注给药的药代动力学结果显示,与溶液组相比,脂质体组中Sal B的AUC由20.37±1.58 μgh/mL增至636.06±27.73μg·h/mL,MRT由0.28±0.01 h延长至1.97±0.09 h,TSN的AUC也有一定程度增加；组织分布结果显示相比于混合溶液,脂质体中三个药物在体内各脏器组织的分布行为均有所改变,尤其在肝脏中的分布均有不同程度增加。Sal B总体血药浓度和组织分布量大于Mix组,提示GTs-lip能有效增加Sal B的体内稳定性。GTs-lip组中TSN在肝、脾、脑组织中的分布均有较明显增加,以肝脏中分布量增加最为明显；肝脏组织分布曲线显示脂质体组各药物曲线下面积均明显高于混合溶液组,肝组织分布药动学参数显示Sal B、TSN、GA在肝组织中的AUC分别是普通溶液的2.11、9.07、2.59倍,Cmax分别是普通溶液的1.76、2.08、1.73倍,提示脂质体能够同时提高三种药物的肝靶向性。结论：本课题结合药物性质和疗效诉求,优选逆向薄膜分散法结合pH梯度法同时包载肝纤维化治疗药对丹参-甘草中不同极性的三个成分Sal B.TSN和GA,经过系统优化和验证,制备得到的复方脂质体工艺稳定、重现性好,三种药物包封率均达80%以上,粒径控制在100-200nm,实现了不同极性三组分共同包载于脂质体的工艺,且该工艺稳定可控。体外细胞药效研究表明GTS一lip能有效抑制人肝星状细胞增殖,且与混合溶液组相比呈现一定的缓释效果,该结果与其体外缓释释药特征结果呼应。药代动力学和组织分布结果显示相比于混合溶液,脂质体中水溶性成分丹酚酸B的稳定性有所提高,三个药物在体内各脏器组织的分布行为有所改变,尤其在肝脏中的分布均有不同程度增加,提示脂质体能够同时提高三种药物的肝靶向性。为GTS-lip靶向治疗肝纤维化提供了实验依据。