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持留菌是细菌的休眠状态,对抗生素具有高度耐受性,与临床上许多复发性感染和慢性感染有关。金黄色葡萄球菌可形成持留菌,本课题组前期研究发现细菌密度可影响其持留菌的形成,但机制不清,本研究进行了探索。目的:1.探究细菌密度影响不同培养阶段金黄色葡萄球菌持留菌形成的分子机制。2.研究甲酸乙酰转移酶基因（pflB）在金黄色葡萄球菌高密度时持留菌形成中的作用及与毒力的关系。方法:1.将金黄色葡萄球菌Newman株对数期菌液用PBS清洗后,原浓度以及浓缩100倍的菌液分别作为对数期低密度和高密度菌液;稳定期菌液用PBS清洗后,原浓度以及稀释1000倍的菌液作为稳定期高密度和低密度菌液。分别加入氨苄青霉素（10μg/mL）和诺氟沙星（200μg/mL）进行抗生素暴露实验,观察不同密度条件下持留菌的形成状况。2.将稳定期和对数期高密度菌液用PBS以1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍比稀释后,加入氨苄青霉素进行抗生素暴露实验,测定在不同稀释度下金黄色葡萄球菌菌液持留菌形成的变化。3.收集金黄色葡萄球菌在不同培养阶段和不同密度的菌体样本进行代谢组学检测,并就差异代谢产物与前期完成转录组测序的差异表达基因进行转录组学和代谢组学联合分析,探索密度影响金黄色葡萄球菌持留菌形成的主要信号通路和分子机制。4.构建重组质粒pMX10-pflB,电转金黄色葡萄球菌Newman株感受态细胞,以同源重组技术敲除pflB,构建ΔpflB。5.采用抗生素（氨苄青霉素,诺氟沙星和庆大霉素）暴露实验观察金黄色葡萄球菌野生株和ΔpflB在不同培养阶段和不同密度下持留菌形成的变化;对比野生株和ΔpflB菌落形态、色素形成及溶血能力的变化;采用QPCR测定不同阶段不同密度菌液中pflB、srrA、srrB的表达水平以及野生株和ΔpflB毒力基因表达情况。6.构建重组质粒pRAB11-pflB,将pRAB11和pRAB11-pflB分别电转野生株（WT）和ΔpflB感受态细胞,获得WT::pRAB11、ΔpflB::pRAB11以及回补株ΔpflB::pRAB-pflB。7.对比WT::pRAB11、ΔpflB::pRAB11以及ΔpflB::pRAB-pflB在高密度时持留菌形成能力的差异;测定三株菌溶血以及主要毒力基因,生物被膜形成能力的变化。结果:1.当高浓度氨苄青霉素（10μg/mL）作用于金黄色葡萄球菌对数期和稳定期高密度菌液时,10d后仍有大量细菌存活,而作用于对数期和稳定期低密度菌液时,分别经6d和3d被完全杀灭。当高浓度诺氟沙星（200μg/mL）作用于对数期和稳定期高密度菌液时,分别在第6d和第7d后被完全杀灭,而作用于对数期和稳定期低密度菌液时,分别在第1d和第2d就完全被杀灭。2.高密度金黄色葡萄球菌菌液经倍比稀释后持留菌的形成能力呈下降趋势,其中对数期高密度菌液经稀释后在菌量从8.8（Log值）到更低的过程中,持留菌形成能力逐渐减弱。稳定期的高密度菌液当初始菌量降低到7.8（Log值）开始到更低的过程中,持留菌形成能力才开始显著减弱。3.代谢组学结果显示,对数期高密度与低密度菌液相比获得显著差异代谢物19个,其中16个上调,3个下调,主要富集于氨基酸代谢、碳代谢、核苷酸代谢、维生素和辅因子代谢、ABC转运系统以及双组分系统等通路。稳定期高密度与低密度菌液相比获得显著差异代谢物39个,其中35个上调,4个下调。主要富集于氨基酸代谢、碳代谢、核苷酸代谢、脂类代谢、ABC转运系统、双组分系统、能量代谢、维生素和辅因子代谢、RNA翻译等通路。4.转录-代谢联合分析显示,对数期高密度菌液比低密度菌液时,差异表达基因和差异代谢物共同参与的通路主要有双组分系统、碳代谢、ABC转运系统、双组分系统、嘌呤代谢、糖酵解和糖异生、氨基酰-转运RNA的合成、氨基酸的生物合成等。稳定期高密度菌液比低密度菌液时,差异表达基因和差异代谢物共同参与的通路主要有双组分系统、碳代谢、ABC转运系统、嘌呤代谢、氮代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸的代谢、氨基酸的生物合成。5.通过验证,本研究成功获得?pflB、WT::pRAB11、ΔpflB::pRAB11以及ΔpflB::pRAB-pflB。6.无论在对数期还是稳定期,高密度菌液中的pflB、srrA、srrB表达水平均显著高于低密度菌液（P＜0.05）。与野生株相比,ΔpflB在对数期和稳定期高密度菌液中对抗菌药物形成持留菌的能力减弱,表现为当氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素完全杀灭ΔpflB时,仍有一定数量的野生株存活。同时,ΔpflB的溶血和色素形成能力低于野生株;主要毒力基因hlgA、hlgB、hlgC、lukS、lukF、lukD、eta、sea、coa、NWMN-1873和hla表达呈显著降低（P＜0.05）。7.WT::pRAB11、ΔpflB::pRAB11、ΔpflB::pRAB-pflB的氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素暴露实验显示,ΔpflB::pRAB11的持留形成能力显著低于WT::pRAB11,在回补pflB后回补株ΔpflB::pRAB-pflB部分恢复了对抗菌药物的耐受性。主要毒力基因检测显示,ΔpflB::pRAB11中hlgA、hlgB、lukS、lukF、coa、sea、eta、NWMN-1873、hla的表达水平显著低于WT::pRAB11（P＜0.05）,且生物被膜形成能力降低。回补pflB后上述毒力因素得到一定程度恢复。结论:1.密度是影响金黄色葡萄球菌持留菌形成的重要因素,菌液中细菌密度增高引发的碳代谢（糖酵解能力增强和乳酸合成增加）、多种氨基酸代谢与合成、维生素和辅因子代谢、核苷酸代谢、双组分系统和ABC转运系统的变化参与了高密度时持留菌的形成。2.pflB参与金黄色葡萄球菌在高密度时的持留菌形成,其作用机制可能与高密度低氧状态下激活双组分系统SrrAB,进一步影响pflB参与碳代谢和能量产生有关。3.pflB与金黄色葡萄球菌主要毒力基因表达、金黄色色素的合成以及生物被膜的形成有关,影响细菌的毒力。