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肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)由收缩型向合成型转化，并从中膜迁移至内膜大量增殖，在肺血管结构重建、低氧肺动脉高压(PAH)形成中起着重要作用。研究PASMCs增殖、凋亡的机制，是探讨低氧PAH、慢性肺原性心脏病及其他血管疾病发生机制的重要方向；而抑制PASMCs增殖，和/或诱导其凋亡，已成为低氧PAH治疗的一个重要思路。研究证实，存在于PASMCs上的Na~+/H~+交换器-1(NHE-1)在缺氧时表达显著增高，引起的细胞内碱化对PASMCs 的增殖具有容许性作用；NHE-1特异性抑制剂可显著抑制PASMCs增殖，减轻肺血管结构重建。而目前已知，细胞内酸化可诱导多种细胞凋亡。因此本实验通过构建NHE-1锤头型核酶的逆转录病毒载体，转染入体外培养的PASMCs内，检测转染后PASMCs在常氧及缺氧培养时细胞凋亡情况及凋亡相关基因的表达，探讨NHE-1在常氧及缺氧PASMCs凋亡中的作用。研究内容：1. 根据计算机软件模拟的大鼠NHE-1 mRNA二级结构，设计并合成两条锤头型核酶，分别克隆于逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点中。2. 原代培养PASMCs成功并鉴定后，用FuGENE6转染试剂将重组载体转染入PASMCs，筛选并鉴定，sqRT-PCR方法检测NHE-1 mRNA表达。3. 检测常氧及缺氧2h、6h、12h、24h、48h时转染细胞的pHi变化、超微结构改变、细胞周期以及原位细胞凋亡率的变化。4. 检测常氧及缺氧2h、6h、12h、24h、48h时转染细胞的[Ca2+]i变化和凋亡相关基因fas、fasL、bcl-2、bax 的mRNA和蛋白表达变化。结果：1. 经DNA测序证实两个核酶逆转录病毒重组载体均构建成功。2. 原代培养的PASMCs经α-SM-actin免疫酶细胞化学染色得到证实。转染细胞经G418(100μg/ml)筛选后获得阳性细胞克隆；RT-PCR和PCR方法检测得出阳性克隆细胞基因组及mRNA内均有Neo基因表达，证明细胞转染成功。SqRT-PCR法检测得出，转染核酶重组载体的细胞内NHE-1 mRNA表达量显著低于正常细胞和转染空载体细胞。<WP=9>3. 常氧培养时，与正常细胞相比，转染NHE-1核酶基因的细胞pHi显著降低，G0/G1期细胞比例显著增高，G2/M期细胞比例显著降低，原位细胞凋亡率显著增加，电镜下见细胞胞核、胞质固缩，凋亡小体形成。4. 缺氧培养时，与正常细胞相比，转染NHE-1核酶基因的细胞pHi未随缺氧时间的延长而增高，且无显著变化，亦未出现G0/G1期细胞比例减少和G2/M期细胞比例增加，而原位细胞凋亡率随缺氧时间的延长而逐渐升高，电镜下较早出现线粒体肿胀、内质网扩张，胞浆内出现髓鞘样结构，缺氧24h并出现细胞明显水肿。5. 常氧培养时，与正常细胞相比，转染NHE-1核酶基因的细胞[Ca2+]i显著增高，bcl-2 mRNA及蛋白表达量显著降低，bax mRNA和蛋白表达量显著增加，fas、fasL的mRNA和蛋白表达量变化均不显著。6. 缺氧培养时，与正常细胞相比，转染NHE-1核酶基因的细胞[Ca2+]i升高幅度明显降低，bcl-2 mRNA及蛋白表达量显著降低，bax mRNA和蛋白表达量显著增加，fas、fasL的mRNA和蛋白表达量变化均不显著。结论：1. 本实验成功地构建了大鼠NHE-1特异性锤头型核酶的逆转录病毒载体，并成功转染入培养的PASMCs内。2. 所设计的NHE-1锤头型核酶可使PASMCs内NHE-1 mRNA的表达量及pHi降低，并抑制PASMCs增殖，诱导PASMCs凋亡。3. 所设计的NHE-1锤头型核酶可阻止缺氧培养的PASMCs的pHi增高，抑制缺氧时PASMCs的增殖，并增加缺氧时PASMCs的凋亡。4. NHE-1锤头型核酶抑制NHE-1后，可能通过引起[Ca2+]i增加、bcl-2表达降低及bax表达增加而诱导PASMCs凋亡。5. NHE-1锤头型核酶抑制NHE-1后，可能通过阻止缺氧培养的PASMCs的[Ca2+]i增加，并引起bcl-2表达降低及bax表达增加而诱导缺氧PASMCs凋亡。6. Fas/FasL死亡通路可能不参与NHE-1锤头型核酶抑制NHE-1而诱导PASMCs凋亡的调控。由此可见，NHE-1抑制导致的细胞内酸化，在抑制缺氧PASMCs增殖的基础上，还诱导缺氧PASMCs凋亡。这为缺氧肺动脉高压肺血管重构的治疗提供新的思路，也为将来应用NHE-1抑制剂治疗缺氧性肺动脉高压提供一定的间接依据。