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本研究以猪卵母细胞为主要材料,体外成熟培养猪卵母细胞,同时分离培养颗粒细胞与胎儿成纤维细胞作为供核细胞,对卵母细胞成熟培养、孤雌激活和核移植的影响因素进行了探讨,为进一步进行转基因猪的研究奠定了基础。实验主要结果如下: (1)研究了不同时间段添加外源激素及不同基础培养液和血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。实验包括,①猪卵母细胞以TCM199+10% FBS+10IU/mL Pregnant Mare Serum Gonadotrophin(PMSG)+10 IU/mL Human Chorion Gonadotrophin(hCG)+2.5 IU/mL Follicle Stimulate Hormone (FSH)为成熟培养液体外培养44 h,前22 h在培养液中加入激素,后22 h 不加入激素及前22 h不加激素,后22 h添加激素和添加激素连续培养44 h;②以实验①中激素添加的方案在体外添加激素连续培养44 h,对不同基础培养液(TCM199 粉剂、TCM199 原液和改良TCM199(mM199))对猪卵母细胞体外成熟进行了研究; ③以实验②中筛选出的mM199组为成熟培养液对比血清有无对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,实验①中3 种激素添加不同时间段其成熟率分别为45.67%、45.29%和46.07%,对猪卵母细胞体外成熟无显著影响(P>0.05);实验②中,mM199 组的成熟率(54.10%)高于TCM199 粉剂组的成熟率(46.16%)及TCM199 原液组的成熟率(47.14%),但差异不显著(P>0.05);实验③中无血清组的成熟率(67.10%)高于有血清清组的成熟率(52.22%),差异显著(P<0.05)。由此可见,mM199 +10 IU/mL PMSG+10 IU/mL hCG+2.5 IU/mL FSH 是一种适合于猪卵母细胞体外成熟的培养液,体外成熟率达67.10%。(2)研究了离子霉素、电场强度、电脉冲次数和电刺激-化学联合激活对猪卵母细胞孤雌激活的影响,以出现分裂球为激活的标准。结果表明:①10 μM 离子霉素处理5 min的激活率60.71%(17/28)与处理10 min、15 min的激活率62.50%(15/24)、65.22%(15/23)差异不显著(P>0.05)。②以电场强度120 v/mm,脉冲次数3 次处理猪卵母细胞的激活率66.67%(30/45)与60 v/mm、80 v/mm、100 v/mm 的激活率40.98%(17/42)、44.11%(15/34)、46.19%(18/39)有显著差异(P<0.05),但与140 v/mm、160 v/mm 的激活率63.89%(23/36)、64.10%(25/39)无显著差异(P>0.05)。③以电场强度120 v/mm,不同电脉冲次数进行激活。以2 次电脉冲激活猪卵母细胞的激活率67.40%(31/46)与1次、2 次电脉冲的激活率62.80%(27/43)、68.30%(28/41)无显著差异(P>0.05)。④以电场强度120 v/mm,2 次电脉冲与10 μM 离子霉素处理5min 联合激活猪卵母细胞的激活率84.84%(29/33)与只用电场强度120 v/mm,2 次电脉冲的激活率64.67%(23/34)差异显著(P<0.05)。实验结果表明:电场强度120 v/mm,2 次电脉冲与10 μM 离子霉素处理5min 联合处理激活能有效提高猪卵母细胞孤雌激活的激活率。(3)本研究利用成熟后的卵母细胞的颗粒细胞,可以简单而快速的进行颗粒细胞的分离与培养;用室温消化法可以分离培养单个细胞分别获得猪胎儿成纤维细胞;在进行冷冻保存后可以成功解冻猪胎儿成纤维细胞(其存活率为83.5%);这样为以后的核移