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凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因位于X染色体长臂远端(Xq28),全长186Kb,占X染色体长度的0.1%,包含26个外显子(占9kb)和25个内含子(占177kb)。经剪接后的FⅧ mRNA长约9kb,是连续的开放阅读框,编码含有2351个氨基酸的前体多肽。FⅧ基因庞大,突变种类繁多并具有高度的异质性。甲型血友病(Hemophilia A, HA)是血液中凝血因子Ⅷ(FⅧ)的遗传性缺陷或基因突变而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病。患者常常发生自发性或外伤后出血不止,出血可发生在任何部位,但以关节出血最为多见,反复多次关节出血可导致患者致残甚至危及生命。该病为X性染色体连锁的隐性遗传病,在男性中的发病率达到1/5000～1/10000。目前,患者的治疗主要采用输注新鲜血液或FⅧ浓缩制剂,但其来源珍惜、价格昂贵,不能满足血友病患者的需要。1984年FⅧ基因体外表达的成功预示着可通过生物技术获得大量高纯度的rFⅧ,作为FⅧ的替代品供临床使用。本研究利用PCR技术从高产荷斯坦奶牛基因组中扩增出α-LA启动子,并克隆入载体T-protruding pCR3中,根据蓝白斑筛选以及限制性内切酶酶切分析得到重组质粒pCR-αLA;从重组质粒pCMV5/hFⅧ中利用限制性内切酶酶切出hFⅧ全基因序列,并克隆至重组质粒pCR-αLA中,同样根据蓝白斑筛选以及限制性内切酶酶切筛选出阳性重组质粒pCR-αLA/hFⅧ-5;以重组质粒pCMV5/hFⅧ为模板分别扩增出hFⅧ A domain和hFⅧ C domain,回收后共同连接至重组质粒pCR-αLA中,用同样方法筛选及鉴定出阳性重组质粒pCR-αLA/hFⅧ(△B).对重组质粒中插入的片段进行序列测定,结果表明插入序列与公开发表的序列完全一致。为进一步建立pCR-αLA/hFⅧ(△B)转基因兔奠定了基础。将重组质粒pCR-αLA/hFⅧ(△B)用限制性内切酶ClaI和XbaI消化,回收纯化约为6.8kb的基因片段。该基因片段包括2.0kb的αLA启动子、4.3kb的hFⅧ(AB)以及0.5kb牛生长激素基因poly A。应用FSH和HCG对6-9月龄的雌性新西兰白兔进行超数排卵,与雄性新西兰白兔交配后,获得受精卵754枚,通过原核显微注射法将αLA-hFⅧ(△B)-bGHpA片段注射到母兔受精卵雄原核中,注射后移植胚胎数328枚,移植受体数13只,受体怀孕数12只,获得仔兔52只,经PCR检测,有4只为转基因阳性兔。仔兔现仅三月龄,尚无后代。本研究利用乳腺特异性表达启动子aLA能使重组人第八凝血因子(rhFⅧ)在乳腺组织中特异且高效表达,生产hFⅧ因子,作为hFⅧ的替代物应用于临床。利用动物作为人类所需蛋白质的生物反应器进行药用蛋白质的大量生产,为商业发展开辟了道路,同时也为基因治疗奠定了基础。