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目的:1、85%NSCLC患者就诊时已处于疾病晚期,经化疗后中位生存期仅为8-10个月。近年来,以EGFR为首的肺癌驱动突变的发现及相应靶向药物的成功应用改写了 NSCLC治疗的篇章。然而,肺癌精准治疗实现的前提是对分子靶点的成功检测,特别是针对小标本及外周血游离DNA中EGFR的突变检测具有相当的挑战性,临床实践亟需建立一种敏感性高、特异性好、方便、快捷的分子检测方法。2、在一代EGFR-TKIs治疗的过程中,50%左右的患者都会由于EGFRT790M的出现而产生获得性耐药,所以实时动态地监测患者EGFR突变状态,以尽早发现耐药突变从而及时调整治疗方案对患者的疗效、预后判断均有重大意义;同时,患者对一代EGFR-TKIs耐药后,在无法获得组织标本的情况下,如何对EGFR T790M的存在做出判断?是否可用三代EGFR-TKIs进行治疗?外周血游离核酸中EGFR T790M的动态实时监测需要通过敏感性高、特异性好的分子检测方法来实现。3、近期Ⅱ期临床试验结果显示BRAF抑制剂如Dabrafenib在BRAF突变的肺腺癌患者中取得了良好的疗效,多个靶向NSCLC BRAF突变患者的药物临床试验也已开展,然而BRAF突变在肺腺癌中的突变情况,BRAF突变与患者临床病理特征的关系目前尚不十分明确,而肺癌患者外周血游离核酸中BRAF突变的检测鲜有报道,建立稳定、高效、敏感的检测平台,对肺腺癌患者的BRAF突变率及其和患者临床病理特征的关系的明确及后续BRAF抑制剂的使用具有深远意义。方法:1、收集2010年11月至2015年11月南京大学附属鼓楼医院144例初治肺腺癌患者的石蜡包埋组织(FFPE)及临床病理资料,应用CastPCR法检测患者FFPE标本中EGFR基因突变状况(包括19外显子de12235-2249、de12236-2250,20外显子T790M,21外显子L858R),分析患者EGFR突变状况与其临床病理学特征的相关性,并与既往结论比较,以探讨CastPCR法用于临床EGFR基因检测的可行性。2、仍使用上述方法中所收集的144例肺腺癌患者的FFPE标本,应用CastPCR法检测其BRAF基因突变状况(包括11外显子G469A,15外显子D594G、V600E),分析患者BRAF突变状况与其临床病理学特征的相关性。3、所收集的144例肺腺癌患者的FFPE标本中,有107例有相应的配对外周血,应用CastPCR法检测外周血游离核酸中EGFR(包括19外显子de12235-2249、de12236-2250,20外显子T790M,21 外显子L858R)、BRAF(包括 11 外显子 G469A,15外显子 D594G、V600E)基因突变状况,比较外周血和组织标本突变一致性。结果:1、在144例初治肺腺癌患者的FFPE中,CastPCR法检出共有51.4%(74/144)患者存在EGFR突变,其中携带敏感突变(19外显子缺失和/或21外显子L858突变)者为40.3%(58/144),携带20外显子耐药突变T790M突变者为14.6%(21/144)。另外,6.9%(10/144)的患者携带双突变,19Del + T790M 者 3例,19Del + L858R者5例,T790M+L858R者2例。EGFR突变率在不同性别、不同吸烟状况之间有统计学差异(P<0.05),而在不同年龄、远处转移情况、分化程度、临床分期、肿瘤直径和区域淋巴结转移情况之间无统计学差异(P≥0.05)。2、在144例初治肺腺癌患者的FFPE中,CastPCR法检出共有8.3%(12/144)患者存在 BRAF 突变,V600E 突变者 2 例(16.7%,2/12),非 V600E突变者 10 例(83.3%,10/12),其中 9 例(75.0%,9/12)为 D594G 突变,1 例(8.3%,1/12)为G469A突变。统计分析结果表明,BRAF突变率在不同性别、年龄、吸烟史、远处转移情况、分化程度、临床分期、肿瘤直径和区域淋巴结转移情况之间均无统计学差异(P≥0.05)。3、与组织配对标本中血浆游离DNA基因突变检测,EGFR:敏感性 56.4%(31/55),特异性 94.2%(49/52),一致性 74.8%(80/107);其中,EGFR敏感突变检测:敏感性57.5%(23/40),特异性95.5%(64/67),一致性81.3%(87/107)。20外显子T790M突变检测:敏感性45.0%(9/20),特异性 100%(87/87),一致性 89.7%(96/107)。BRAF:敏感性 28.6%(2/7),特异性 93.0%(93/100),一致性 95.3%(102/107)。结论:CastPCR法可成功检测肿瘤组织中EGFR、BRAF等基因突变情况,具有方便、高效、可重复性高等特点,尤其在对EGFRT790M突变的检测上,其优于目前临床常用的直接测序法及ARMS法。对于因种种原因难以获取肿瘤组织的患者,CastPCR法对其血浆的EGFR突变检测具有高度特异性、一致性及一定的敏感性,故可作为难以获取组织时合适的检测替代方法。我们首次使用CastPCR法在100余例肺癌患者外周血标本中探索了 BRAF突变,发现特异性、一致性均较理想,但敏感性不高,分析可能与肿瘤异质性、BRAF游离核酸丰度低、组织标本等因素有关,希望未来有更多的研究进一步优化血浆游离核酸BRAF突变的检测。