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慢性喉炎是喉部高发的疾病之一,占所有喉部疾病的10%-20%。严重的慢性喉炎不仅直接影响发声、吞咽和呼吸功能,而且会引起喉部粘膜异常增生甚至癌变,严重地影响人们的健康、工作和生活。目前临床治疗上采用一般性的抗炎抗菌治疗,尚没有特效的治疗手段。临床研究表明,常规治疗无法完全逆转病理变化,这可能是导致慢性喉炎难以根治,病程反复发作迁延不愈的原因之一,因此彻底治愈慢性喉炎,已成为当今耳鼻咽喉科学面临的一个亟待解决的难题。研究认为慢性炎症可造成局部组织内功能细胞、间质细胞和神经血管间稳态的整体破坏,从而引起组织功能异常,而间充质干细胞在稳态的维持中发挥着重要的作用。在慢性喉炎的发生过程中是否存在间充质干细胞的功能缺失值得探究。我们从喉粘膜局部分离得到一群喉粘膜间充质干细胞,其高表达间充质干细胞的表面标志,具有多向分化,免疫调节,组织修复等多种潜能。随着分子生物学技术的发展,明确慢性炎症环境中喉粘膜间充质干细胞功能损伤的分子机制,成为探究慢性喉炎发生发展的新方向。近期研究发现,间充质干细胞可调节T细胞功能从而在免疫疾病的治疗中发挥重要的免疫调节作用。喉作为胃肠系统与呼吸系统的交叉点,具有重要的免疫学功能。目前喉粘膜间充质干细胞在声带再生与修复等方面有着广泛的研究,但关于其在慢性炎症环境中生物学功能的改变,特别是免疫调节功能改变的研究较少。了解慢性炎症环境中喉粘膜间充质干细胞功能的变化有助于更好的理解慢性喉炎损伤的机制,并为相应的预防和治疗提供理论基础。既往研究证明在以肿瘤坏死因子α(TNF-α)为主的慢性炎症环境中,间充质干细胞的组织再生功能会受到显著影响。值得注意的是,研究表明这种组织再生功能缺陷在脱离了炎症微环境后仍然持续存在,即使经过体外多次传代也无法逆转,这提示长期炎症引起喉粘膜间充质干细胞不可逆的功能缺陷,可能是导致慢性喉炎难以根治的原因之一。这种可在下一代细胞中稳定遗传的功能缺损提示其发生机制可能与表观遗传学相关。乙酰基转移酶复合体5(GCN5)作为最早发现也是最重要的乙酰化转移酶之一,在胚胎发育、干细胞功能维持与间充质干细胞命运决定中发挥着重要的调控作用。我们实验室在前期研究中也发现GCN5在骨髓与牙周膜间充质干细胞的功能维持中发挥重要作用,因此我们探究了以TNF-α为主的慢性炎症环境中喉粘膜间充质干细胞的功能缺损与GCN5的关系。目的:1.分离培养喉粘膜间充质干细胞,探究TNF-α对喉粘膜间充质干细胞增殖,成骨分化,成脂分化和免疫调节能力的影响。2.探究TNF-α慢性刺激后GCN5的变化,GCN5与喉粘膜间充质干细胞成骨分化,成脂分化,免疫调节能力的关系。3.探究TNF-α慢性刺激后GCN5调节喉粘膜间充质干细胞免疫调节功能的潜在分子机制,为慢性喉炎的临床治疗提供依据。方法:1.取喉癌全切手术患者组织标本中的正常喉粘膜组织,通过酶消化法分离培养鉴定喉粘膜间充质干细胞。2.通过成骨、成脂诱导分化实验,体外直接共培养实验检测TNF-α慢性刺激后喉粘膜间充质干细胞的分化能力及免疫调节能力的变化。3.通过Western Blot和qRT-PCR等方法检测TNF-α慢性刺激后的喉粘膜间充质干细胞的表观遗传基因GCN5的表达情况。此外通过GCN5的过表达及干扰载体探究GCN5对LM-MSCs成骨、成脂分化能力和免疫调节能力的影响。4.通过Western Blot和qRT-PCR等方法探究TNF-α慢性刺激后GCN5调控喉粘膜间充质干细胞免疫调节功能的潜在机制。结果:1.喉粘膜间充质干细胞的分离培养及鉴定流式细胞检测结果证明喉粘膜间充质干细胞表达间充质干细胞特有的表面标志,具有多向分化潜能,具有一定的免疫调控能力。2.慢性TNF-α刺激后喉粘膜间充质干细胞行为学功能的变化体外建立TNF-α长时间刺激模型,采用适宜的TNF-α浓度(100 ng/mL)对正常来源的喉粘膜间充质干细胞进行长时间(3 d及7 d)的刺激。实验结果证明,慢性TNF-α刺激对喉粘膜间充质干细胞的增殖能力无显著性影响;可抑制喉粘膜间充质干细胞的成骨、成脂分化能力,抑制喉粘膜间充质干细胞的免疫调节能力。3.TNF-α通过GCN5介导的表观调控影响喉粘膜间充质干细胞的行为学功能结果显示慢性炎症刺激后喉粘膜间充质干细胞中GCN5的表达及重要乙酰化修饰位点的乙酰化水平降低。通过过表达和干扰载体调节喉粘膜间充质干细胞中GCN5的表达发现,GCN5调控喉粘膜间充质干细胞的成骨分化、成脂分化和免疫调节能力。4.TNF-α导致喉粘膜间充质干细胞免疫调节功能缺失的机制研究在体外TNF-α长时间刺激模型中,我们发现FAS和FASL的表达与GCN5表达变化相一致。通过GCN5过表达和干扰载体证明GCN5通过调节喉粘膜间充质干细胞FAS和FASL的表达发挥免疫调节的作用。结论:通过本课题研究,我们发现TNF-α慢性刺激后,喉粘膜间充质干细胞的成骨、成脂分化能力和免疫调节能力受损。在慢性炎症环境中,GCN5介导的表观遗传修饰调节喉粘膜间充质干细胞的生物学功能。在免疫调节方面,GCN5可通过调节喉粘膜间充质干细胞表面FAS和FASL的表达,从而影响其免疫调节能力。