研究背景及目的慢性脑低灌注（Chronic cerebral hypoperfusion,CCH）是指脑血流量（Cerebral blood flow,CBF）慢性而持久的、中度减少的状态,可以导致血管性认知障碍（Vascular cognitive impairment,VCI）,包括血管性痴呆（Vascular dementia,VD）的发生和发展。然而目前临床无确切的治疗手段。皮层CBF的减少和海马神经元死亡是CCH导致VCI的初始和重要病理特征,因此促进皮层脑灌注的恢复和减少海马神经元死亡是改善CCH所致认知障碍最符合逻辑的治疗,但其涉及的机制和可干预手段尚不清楚。高效的蛋白抗体芯片技术能有效地识别疾病或药物相关的生物标志物。丁苯酞（Dl-3-n-butylphthalide,NBP）是一种外消旋体、脂溶性小分子,能够穿透血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）,具有多靶点效应,已被证实在多种神经系统疾病的治疗中安全、有效。然而NBP干预CCH的具体分子机制尚不明确。因此,CCH导致VCI的具体分子机制,以及NBP干预的潜在治疗靶点值得进一步探究。材料及方法1.第一部分42只大鼠被随机分为假手术组（N=10）,CCH组[CCH 2周（N=11）;CCH 4周（N=10）;CCH 8周（N=11）]。应用颈部小切口双侧颈总动脉双重结扎（Bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）法制作CCH大鼠模型（设置3个时间点CCH 2周、CCH 4周、CCH 8周）。并综合应用磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）的动脉自旋标记（Arterial spin labeling,ASL）和磁共振血管成像（Magnetic resonance angiography,MRA）技术动态测定CBF和双侧椎动脉（Vertebral artery,VA）的直径变化,弥散张量成像（Diffusion tensor imaging,DTI）联合LFB、MBP免疫染色评价脑白质损害程度,经Morris水迷宫行为学测试系统评价在不同时间点CCH大鼠学习和记忆的认知功能变化,评价CCH大鼠VCI模型建立的可行性;并进一步检测CCH大鼠不同时间点皮层Aβ1-42沉积的情况、BBB相关蛋白的表达、海马区神经元形态的改变,评价CCH大鼠模型脑组织的神经病理改变。2.第二部分94只大鼠被随机分为假手术组[假手术组2周（N=11）、假手术组4周（N=8）、假手术组8周（N=11）],CCH组[CCH 2周（N=12）;CCH 4周（N=12）;CCH 8周（N=12）],CCH+NBP干预组[NBP 2周（N=9）;NBP 4周（N=9）;NBP 8周（N=10）]。首先应用抗体芯片技术,分析CCH组各时间点（CCH 2周、CCH 4周、CCH 8周）与假手术组相比较的皮层差异表达蛋白,以及时间序列分析差异表达蛋白。并对这些皮层差异表达蛋白进行GO和KEGG生物功能分析。对感兴趣的CCH大鼠皮层的差异表达蛋白进行STRING蛋白质相互作用网络分析,并用Western blot和免疫染色对其表达水平进行验证;进一步应用NBP对CCH大鼠进行干预,设置与CCH组相对应的时间点（NBP 2周、NBP 4周、NBP 8周）,观察NBP干预后皮层感兴趣蛋白的表达变化。免疫荧光染色分析VEGF和CD34阳性细胞的表达,Pearson直线相关分析Tie-2与VEGF和CD34阳性细胞的相关性,CD34+Ki67标记微血管新生。用MRI的ASL测定CBF变化、DTI测定脑白质纤维变化、MRA评价干预前后的VA的直径变化,探究NBP干预后促进血管生成从而改善CCH大鼠皮层CBF的潜在靶点。3.第三部分49只大鼠被随机分为假手术组8周（N=13）,CCH 8周组（N=18）,CCH 8周+NBP干预组[NBP 8周（N=18）]。应用抗体芯片技术,分析CCH 8周（CCH所致VCI大鼠）与假手术组相比较的海马差异表达蛋白。对这些差异表达蛋白进行GO和KEGG生物功能分析。并再次应用抗体芯片技术分析假手术组、CCH 8周组、CCH 8周+NBP干预组（NBP组）三组的海马差异表达蛋白。对差异表达蛋白进行生物保守性分析,选取感兴趣的且保守程度最高的CCH大鼠海马差异表达蛋白,进行STRING蛋白质相互作用网络分析,并用Western blot对蛋白的表达水平进行验证,用免疫荧光染色分析感兴趣蛋白与三种神经细胞（Neu N标记的神经元;GFAP标记的星形胶质细胞;Iba1标记的小胶质细胞）的定位关系。用Morris水迷宫行为学测试系统评价三组大鼠的认知功能变化。用HE、尼氏、TUNEL染色和透射电镜分析三组大鼠海马中神经元的变化,Western blot分析凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3）,及p-AKT、p-ERK1/2信号的表达情况。进一步建立原代海马神经元培养体系,应用OGD/R作为体外CCH模型,选取NBP预处理和Ret抑制剂干预海马神经元的最佳浓度,在体外不同环境中（正常;正常+OGD/R;正常+OGD/R+NBP;正常+Ret抑制剂;正常+OGD/R+Ret抑制剂;正常+OGD/R+Ret抑制剂+NBP）,应用Western blot和免疫荧光染色评价感兴趣蛋白的表达变化及神经元凋亡的情况,神经元存活率用CCK8进行检测。探究NBP预处理后减少CCH所致大鼠海马神经元凋亡的潜在靶点。结果1.结果一根据ASL结果,与BCCAO术前比较,发现自BCCAO造模后即刻、BCCAO造模后1周、2周、4周、直至BCCAO术后第8周,大鼠脑皮层的CBF仍处于低灌注状态;DTI结合MBP、LFB染色显示BCCAO术后4周和8周,大鼠伴有显著的脑白质损害;Morris水迷宫行为学测试显示BCCAO术后2周、BCCAO术后4周、BCCAO术后8周,与假手术组相比,大鼠逃避潜伏期延长,穿越平台的次数减少,提示大鼠存在认知功能的损害。以上结果表明BCCAO法能够建立CCH相关的VCI大鼠模型（BCCAO术后2周即CCH 2周,BCCAO术后4周即CCH 4周,BCCAO术后8周即CCH 8周）。此外,BCCAO术后4周和8周,大鼠的皮层,Aβ1-42细胞内沉积、BBB受损;在BCCAO术后4周、BCCAO术后8周,大鼠海马（CA1和CA3区域）的神经元发生显著的迟发性丢失死亡（凋亡）。2.结果二与假手术组相比,CCH组大鼠3个不同时间点（CCH 2周、CCH 4周、CCH 8周）的大脑皮层有7个差异表达蛋白（Tie-2、CNTFRα、IL-4、IL-10、整合素αMβ2、MDC、TROY）。时间序列分析显示,与假手术组相比,CCH组大鼠的大脑皮层有10个差异表达蛋白（TIMP-3、TAL1A、IL-10、FADD、IL-6、LIX、整合素αMβ2、CCR4、Tie-2、b FGF）。其中,Tie-2蛋白是唯一一个在CCH组的3个时间点均表达下调的蛋白,因此将Tie-2作为感兴趣靶蛋白进行进一步的分析验证及NBP干预研究。STRING分析显示Ang-1和Ang-2蛋白与Tie-2蛋白高度相关,形成Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴。应用Western blot和免疫染色实验,我们发现在CCH组中,与假手术组相比,Tie-2蛋白表达与抗体芯片结果一致,在CCH整个过程（3个时间点）均显著下调;在CCH早期阶段（CCH 2周,CCH 4周）,Ang-1的表达下调,在晚期（CCH 8周）有所上调;Ang-2表达在CCH的3个时间点均显著上调。应用NBP干预后,Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴的表达发生改变:NBP干预显著上调Tie-2的表达;在NBP干预早期（NBP 2周和NBP 4周）,Ang-1表达显著上调;在NBP干预晚期（NBP 8周）,Ang-2表达显著下调。同时,在NBP干预的CCH大鼠皮层中,干预早期（NBP 2周和NBP 4周）VEGF和CD34阳性细胞数/CD34+Ki67微血管新生显著增加;Tie-2与VEGF/CD34阳性细胞数存在正的直线相关。与CCH 8周相比,NBP干预组（NBP 8周）大鼠的双侧VA直径显著增加;与CCH 8周组相比,ASL显示NBP干预组（NBP 8周）大鼠的皮层CBF已经恢复至基态水平;DTI显示NBP干预组脑白质纤维密集程度增加。在Ang-1/Ang-2/Tie-2信号中,Ang-1和Tie-2促进血管新生、成熟和稳定,Ang-2能够破坏血管稳定性,并可增加血管或BBB的通透性。该部分结果提示CCH大鼠模型的皮层低灌注与Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴的变化相关,NBP通过调控Ang-1/Ang-2/Tie-2信号轴,促进CCH大鼠皮层的血管生成和重塑,改善CBF。3.结果三与假手术组相比,在CCH 8周大鼠（即CCH所致VCI大鼠）的海马中,存在6个差异表达蛋白（E-选择素、Fractalkine、GFRα1、GFRα2、IL-3、Insulin）。在NBP干预后,应用抗体芯片再分析结果显示,TIMP-1、ACTH、GFRα1共3个蛋白在VD大鼠海马中表达下调,而在假手术组和NBP干预组的海马组织中上调。其中GFRα1蛋白的生物保守性最好,提示与人类的蛋白序列最为相似,因此我们以GFRα1作为感兴趣靶蛋白进行进一步研究。STRING分析显示GDNF和Ret蛋白与GFRα1蛋白高度相关,形成GDNF/GFRα1/Ret信号轴。应用Western blot和免疫染色,我们发现在CCH 8周的大鼠海马组织中,与假手术组相比,GDNF/GFRα1/Ret信号表达均下调。应用NBP进行干预后,海马CA1和CA3区的神经元凋亡显著减少,GDNF/GFRα1/Ret信号表达显著上调,且GDNF/GFRα1/Ret蛋白与海马神经元共定位,p-AKT和p-ERK1/2被激活。我们进一步通过原代海马神经元体外实验,应用OGD1h/R48h（OGD/R）来模拟海马神经元的体外缺氧环境,OGD/R显著下调GDNF/GFRα1/Ret和p-AKT、p-ERK1/2表达,增加神经元凋亡（减少神经元的存活率）。Ret抑制剂能够抑制Ret表达,并抑制其上游GDNF/GFRα1及下游p-AKT、p-ERK1/2的表达,增加神经元凋亡（减少神经元的存活率）。GDNF/GFRα1/Ret和p-AKT、p-ERK1/2的表达下调,以及海马神经元的凋亡在合并OGD/R和Ret被抑制的作用下愈加明显。而经NBP预处理的海马神经元在OGD/R和/Ret被抑制的环境下,均能够上调GDNF/GFRα1/Ret信号和p-AKT、p-ERK1/2的表达,减少海马神经元的凋亡（增加神经元的存活率）。此部分内容显示,CCH导致海马神经元GDNF/GFRα1/Ret信号的下调是导致大鼠海马神经元凋亡的机制,而NBP的干预能够激活GDNF/GFRα1/Ret信号及下游p-AKT和p-ERK1/2,保护海马神经元,从而改善认知功能。结论1.应用BCCAO法,导致大鼠皮层持续的低CBF状态合并认知障碍,表明成功建立CCH所致VCI大鼠模型。同时,在建立的CCH大鼠模型中,发生脑白质损伤,Aβ1-42细胞内沉积,BBB损伤,海马神经元迟发性死亡（凋亡）。2.通过抗体芯片技术,发现CCH大鼠的大脑皮层及海马中的差异蛋白谱,这些差异蛋白生物功能涉及细胞因子、生长因子、神经元死亡、能量通路等;Tie-2是CCH大鼠的皮层组织的感兴趣靶蛋白;GFRα1是CCH大鼠的海马组织的感兴趣靶蛋白,用于进一步的研究。3.在CCH大鼠的皮层中,低CBF状态与Ang-1/Tie-2表达下调和Ang-2表达上调相关;NBP通过调控皮层Ang-1/Ang-2/Tie-2信号的变化,促进血管新生和重塑,从而改善CCH大鼠皮层CBF、减轻脑白质损害;4.在CCH大鼠的海马中,海马神经元凋亡与GDNF/GFRα1/Ret信号的下调相关;NBP通过上调海马中GDNF/GFRα1/Ret信号表达水平,减少海马神经元凋亡、促进海马神经元存活,改善CCH所致VCI大鼠的认知障碍。