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STAT3及SoCS3信-N-分子在肝前体细胞增殖分化过程中的作用前言肝脏具有较强的再生能力，当肝损伤较轻时，通常由残存的肝细胞再生以代偿肝功能。但当严重肝损伤或其他原因影响了正常肝细胞的复制增殖能力时，可以有肝干细胞的活化、增殖和分化。成年哺乳动物肝脏存在着具有分化潜能的细胞，称为肝前体细胞(Hepatic progenitor cell，HPC)。在一定环境因素的作用下可以增殖，并分化为肝细胞及胆管细胞。但HPC的活化、增殖及分化机制尚不清楚。信号转导子和转录激活子3(Signal transducer and activator of transcription3，STAT3)参与了许多细胞因子及生长因子介导的细胞增殖及分化过程。细胞因子信号抑制子3(Suppressors of cytokine signaling3，SOCS3)是JAK／STAT3信号通路的负反馈调节因子。STAT3的活化可以促进SOCS3的产生，而SOCS3则可抑制细胞因子激活的STAT3信号的表达。但其在HPC增殖及分化过程中的作用尚不清楚。本文旨在探讨肝衰竭组织中HPC的增殖特点及其与STAT3及SOCS3表达的关系。并进一步以大鼠肝干细胞样上皮细胞系WB-F344(简称WB细胞)为研究对象，探讨STAT3及SOCS3在WB-F344细胞增殖及分化过程中的作用。方法(1)本研究采用肝衰竭组织及急、慢性轻型肝炎组织标本共76例，病例选自1965年-2005年中国医科大学第一临床学院尸检病例、肝脏外科手术病例及肝活检病例。所有病例肝组织标本均经甲醛固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片进行HE染色以观察病变特点；应用免疫组织化学方法(S-P法)进行OV6、CK19、p-STAT3及SOCS3的检测。结果判定：①OV6免疫组化染色半定量：OV6阳性表达于细胞浆。每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞的百分数。“—”：无HPC或有少量HPC；“+”：灶性HPC；“++”：连续性HPC，但范围＜50％汇管区和纤维间隔；“+++”：连续性HPC，但范围＞50％汇管区和纤维间隔。以“—”为阴性，“+”“++”及“+++”为阳性。②CK19、p-STAT3及SOCS3免疫组化染色结果判定：每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞的百分数。CK19及SOCS3表达于细胞浆中，p-STAT3表达于细胞核，呈现棕色染色颗粒。无着色或阳性表达率≤25％为阴性，＞25％为阳性。(2)以大鼠肝干细胞样上皮细胞系WB-F344细胞为研究对象，肝细胞生长因子(Hepatic growth factor，HGF)及JAK／STAT3通路抑制剂AG490作用于WB-F344细胞后，应用免疫荧光及Western blot方法检测HGF及AG490作用后细胞STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表达；应用RT-PCR方法检测HGF及AG490作用后细胞SOCS3 mRNA的表达；应用流式细胞术及MTT法检测HGF及AG490作用后细胞的细胞周期及凋亡的变化。(3)应用HGF、表皮生长因子(Epithelial growth factor，EGF)、胰岛素及地塞米松组成诱导分化体系(高糖DMEM，10％胎牛血清，HGF 10-50ng／ml，EGF 20ng／ml，胰岛素1μg／ml及地塞米松1μmol／l)，体外诱导WB-F344细胞向肝细胞定向分化。观察分化过程中不同时点WB-F344细胞形态的变化。应用RT-PCR方法鉴定WB-F344细胞定向分化过程中分化标志白蛋白(Albumin，ALB)、甲胎蛋白(Alpha-1-fetoprotein，AFP)及细胞角蛋白19(Cytokeratin，CK19)的表达。应用Western blot方法检测WB-F344细胞定向分化过程中STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表达；应用RT-PCR方法检测细胞分化过程中SOCS3 mRNA的表达。(4)统计方法：所有资料采用SPSS13.0统计软件进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。结果(1)CK19免疫组化染色结果表明：亚急性肝衰竭((subacute liver failure，SALF)、及慢加急性(亚急性)肝衰竭((acute-on-chronic liver failure，ACLF)组织中可见大量增生的胆管，包括典型增生胆管和非典型增生胆管。肝衰竭组织的CK19阳性率(62.5％)明显高于急、慢性轻型肝炎组织的阳性率(30％)(P＜0.05)；OV6作为肝前体细胞的标记抗体，其染色阳性的细胞主要有两种形式。大部分是组成非典型增生胆管的管状细胞；另一种是汇管区出现的小肝细胞样细胞。肝衰竭组织的OV6阳性率(85.7％)明显高于急、慢性轻型肝炎组织的阳性率(35.0％)(P＜0.05)；p-STAT3的阳性表达主要位于汇管区增生的胆管细胞、HPC、炎性细胞、窦内皮细胞及肝细胞的细胞核中。肝衰竭组织的p-STAT3阳性率(67.9％)明显高于急、慢性轻型肝炎的组织的阳性率(25％)(P＜0.05)；SOCS3的阳性表达主要位于汇管区的增生的胆管细胞、炎性细胞及肝细胞的细胞浆中。肝衰竭组织的SOCS3阳性率(60.7％)明显高于急、慢性轻型肝炎组织的阳性率(35％)(P＜0.05)。相关分析表明，OV6的表达与CK19、p-STAT3及SOCS3的表达呈正相关(r_s分别为0.689，0.239及0.322，P＜0.05)。(2)STAT3水平在HGF作用于WB-F344细胞前后无明显变化(P＞0.05)；HGF能够促进STAT3的磷酸化，p-STAT3在HGF作用10分钟后增加，完全磷酸化发生在HGF作用30分钟，60分钟后表达逐渐减弱。应用AG490后p-STAT3表达减弱(P＜0.05)；正常WB-F344细胞有SOCS3蛋白及mRNA表达，在HGF作用10分钟后SOCS3表达增加，以后逐渐减弱。应用AG490后SOCS3表达减弱(P＜0.05)。HGF作用于WB-F344细胞后细胞周期S期细胞数增加，G1期细胞数减少，凋亡细胞减少，这种作用呈剂量效应关系(P＜0.05)。应用AG490后能够抑制WB-F344细胞的增殖，促进细胞凋亡。(3)WB-F344细胞在加入分化培养体系2天后细胞出现离散效应。实验7天后细胞延伸并形成小梁样结构，细胞逐渐由六边形转变为梭形。21天后分化为肝细胞样梭形形态，细胞生长缓慢，形态逐渐出现分散。RT-PCR方法检测表明细胞分化过程中表达肝细胞标志ALB的水平逐渐增加，作为肝干细胞标志之一的AFP的表达逐渐减少，CK19这一胆管细胞的表达标志逐渐减少(P＜0.05／)。上述结果提示HGF、EGF、胰岛素及地塞米松可以诱导WB-F344体外向肝细胞定向分化。应用Western blot方法检测表明STAT3蛋白在分化过程中无明显变化(P＞0.05)；p-STAT3蛋白表达在分化过程中逐渐减少(P＜0.05)；应用RT-PCR及Western blot方法检测表明SOCS3 mRNA及蛋白表达在分化过程中逐渐减少(P＜0.05)。结论(1)肝衰竭组织中存在HPC的增殖；肝衰竭组织中p-STAT3及SOCS3的表达增加，与HPC表达成正相关。提示p-STAT3及SOCS3参与肝衰竭组织中HPC增殖的调控。(2)HGF能够促进WB-F344细胞STAT3的磷酸化水平，增加SOCS3表达；HGF能够促进WB细胞的增殖并抑制细胞凋亡，STAT3及SOCS3参与了这一过程的调控。(3)HGF、EGF、胰岛素及地塞米松组成的分化培养体系能够体外诱导WB-F344细胞向肝细胞定向分化；分化过程中p-STAT3及SOCS3的表达逐渐减少，提示其可能对于抑制WB-F344细胞的分化，使其维持未分化状态具有重要的作用。