肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮的恶性肿瘤，包含透明细胞性肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳头状肾细胞癌（papillary renal cell carcinoma，PRCC）、粘液样小管状和梭形细胞癌（mucinous tubular spindle cell carcinoma，MTSCC）和Xp11.2易位性/TFE3基因融合相关性肾癌等等。尽管不同类型肾癌病理表现各异，但文献回顾发现，透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌中存在部分含有胞质嗜酸性包涵体（eosinophilic cytoplasmic inclusion，ECI）的罕见病例。光镜分析发现胞质嗜酸性包涵体主要定位于细胞质，呈圆形、椭圆形或不规则形，大小不等，嗜伊红性较强，与周围细胞质界限清楚。电子显微镜观察发现胞质嗜酸性包涵体主要由蛋白样物质构成，有时其边沿会部分或完全被电子致密的圆形颗粒物质包裹。但除透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌外，其他类型的肾癌是否也会产生胞质嗜酸性包涵体亦值得探索，这种胞质嗜酸性包涵体的本质和形成原因也值得深入研究。　　自噬（autophagy）是真核生物体内一种非常保守的生物学过程，它通过将异常折叠蛋白、泛素化修饰蛋白和（或）损伤的细胞器等底物包裹进自噬小体，并与溶酶体融合、将之降解，以确保细胞内物质循环利用和稳态维持。相应地，自噬功能缺陷势必会造成非常严重的后果，甚至导致生物个体的死亡。但最为常见的结果是自噬潮（autophagic flux）被阻断，引起自噬标志蛋白LC3和自噬受体蛋白P62降解障碍，聚集形成P62阳性的细胞内包涵体（intracellular inclusion），即P62小体（P62body）。因此，P62阳性的细胞内包涵体的形成就成为了自噬异常的标志。Atg5基因敲除小鼠和Atg7基因肝脏特异性敲除小鼠的肝脏病变组织中即可见到P62小体的形成。人体肝脏病变组织中的细胞内透明小体（intracellular hyaline body，IHB）中亦可检测到P62和过氧化物酶体自噬（pexophagy）受体NBR1的存在。而过氧化物酶体自噬功能异常时亦可观察到NBR1、P62和过氧化物酶体的蓄积。包涵体肌炎病变组织中甚至能够发现BECN1、LC3和P62等自噬相关标志蛋白的分布。上述研究表明，P62、NBR1、LC3、BECN1和过氧化物酶体等均可能是自噬功能异常所致的细胞内包涵体的重要组成成分。　　自噬与肾癌的发生、进展及包涵体形成关系密切。研究发现，BECN1的表达量与肾癌预后和药物治疗相关。LC3B可能参与了肾癌由低级别向高级别转化过程，沉默LC3B可减弱移植瘤形成能力。自噬调节基因VHL缺失与肾癌发生密切相关。而在小鼠肝脏组织中条件性剔除Atg7基因会导致过氧化物酶体自噬缺陷和良性肿瘤形成，神经系统剔除Atg7基因会引起包涵体形成。与之相似，小鼠肝脏Atg5基因缺陷亦会引起胞质嗜酸性包涵体的产生。　　尽管自噬与肾癌和包涵体关系密切，但肾癌中胞质嗜酸性包涵体的形成是否由自噬缺陷所引起，其生物学本质和组成成分是什么，包绕在胞质嗜酸性包涵体周围的电子致密颗粒到底是什么等问题却尚未阐明，胞质嗜酸性包涵体的形成机制亦值得深入探讨。　　目的:　　（1）明确除透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌外，其他类型的肾细胞癌是否也会产生胞质嗜酸性包涵体；（2）阐明肾癌中胞质嗜酸性包涵体形成与自噬缺陷的关系和胞质嗜酸性包涵体的生物学本质，并探明其主要组成成分；（3）鉴别包绕在胞质嗜酸性包涵体周围的电子致密颗粒细胞器类型；（4）利用现有研究结果，初步阐释胞质嗜酸性包涵体的形成机制；（5）明确胞质嗜酸性包涵体产生的原因，阐明自噬相关基因突变在自噬缺陷和包涵体形成中的作用，体外复制含胞质嗜酸性包涵体的肾癌细胞模型，为进一步阐明胞质嗜酸性包涵体形成机制提供实验模型。　　方法:　　（1）含胞质嗜酸性包涵体的肾癌病理分类：课题组从多家医院收集了10例含胞质嗜酸性包涵体的肾癌标本，并通过HE染色、免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测，确定了含胞质嗜酸性包涵体的肾癌病理分类；　　（2）胞质嗜酸性包涵体形成与自噬缺陷的关系、胞质嗜酸性包涵体的生物学本质鉴定和主要组成成分分析：利用收集的含胞质嗜酸性包涵体的肾癌标本，采用HE染色、Masson染色、PAS染色、透射电镜分析、免疫组织化学染色和免疫荧光染色等技术，明确了胞质嗜酸性包涵体的形态学特点和超微结构特征，阐明了其组成成分和生物学本质，并明确了其与自噬缺陷的关系；　　（3）包绕在胞质嗜酸性包涵体周围的电子致密颗粒的细胞器鉴定：使用含胞质嗜酸性包涵体的肾癌标本，采用透射电镜、免疫组织化学、免疫荧光和三维重建技术，明确了包绕在胞质嗜酸性包涵体周围的电子致密颗粒细胞器类型；利用免疫染色和超微结构分析结果，初步阐释了其形成机制；　　（4）胞质嗜酸性包涵体产生的原因，自噬相关基因突变在自噬缺陷和包涵体形成中的作用以及体外复制含胞质嗜酸性包涵体的肾癌细胞模型：提取含胞质嗜酸性包涵体的肾癌标本基因组DNA，采用全外显子组测序和Sanger测序技术，明确了自噬相关基因在含胞质嗜酸性包涵体肾癌中的突变特点；构建了携带ATG5基因突变体（ATG5p.F165L）的慢病毒表达载体，并采用慢病毒感染构建了肾癌稳转细胞株，再采用Real-time RT-PCR和Western blot等方法进行过表达分析；最后采用HE染色和免疫荧光染色探索了肾癌细胞株中胞质嗜酸性包涵体的形成。　　结果:　　（1）发现除透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌外，胞质嗜酸性包涵体在粘液样小管状和梭形细胞癌中亦可被检查到；低级别肾癌组织中并不存在胞质嗜酸性包涵体；　　（2）胞质嗜酸性包涵体是自噬缺陷的产物，且主要分布于核分级较高的肾癌组分中。光镜下为嗜伊红的、圆形或椭圆形团块，主要定位在细胞质中，与周围界限清楚；超微结构分析发现，胞质嗜酸性包涵体是由纤维样蛋白物质构成，部分包涵体被电子致密颗粒包绕；P62、NBR1、LC3、BECN1、ATG5、GM130等蛋白和过氧化物酶体是胞质嗜酸性包涵体的重要组成部分，胞质嗜酸性包涵体是由纤维样蛋白和（或）过氧化物酶体组成的复合物；包绕胞质嗜酸性包涵体的电子致密颗粒为过氧化物酶体，由纤维样蛋白物质和过氧化物酶体构成的复合物是过氧化物酶体自噬缺陷的产物；　　（3）通过全外显子组测序和Sanger测序分析，发现了ATG5p.F165L、ATG7p.E452D、ATG10p.T212M、ATG10p.P220H、RB1CC1p.M234T和ATG16L1p.T300A等新的变异转录本，对应突变频率分别为10%、20%、100%、100%、90%和40%，其中ATG5p.F165L和ATG7p.E452D为新发现的体细胞突变，而ATG10p.T212M、ATG10p.P220H、RB1CC1p.M234T和ATG16L1p.T300A为已知单核苷酸多态性位点；而对TCGA数据库中的932例不含胞质嗜酸性包涵体的肾癌分析发现，上述突变位点或变异转录本并不存在。提示上述碱基变异可能参与了自噬缺陷和胞质嗜酸性包涵体形成。课题组随后选择了ATG5p.F165L进行进一步研究，构建了携带ATG5p.F165L突变体的表达载体并进行了慢病毒包装，以获得携带ATG5p.F165L突变体的肾癌衍生细胞株。RT-PCR和Western blot检测证实感染慢病毒后的衍生细胞的ATG5和ATG5p.F165L并未能高表达，HE染色和免疫荧光染色证实衍生细胞中并未出现胞质嗜酸性包涵体。　　结论:　　综合课题研究，课题组发现除透明细胞性肾细胞癌和乳头状肾细胞癌外，粘液样小管状和梭形细胞癌亦可产生胞质嗜酸性包涵体，胞质嗜酸性包涵体是自噬缺陷的产物；胞质嗜酸性包涵体可能提示患者预后不良；胞质嗜酸性包涵体主要由P62、LC3、BECN1、ATG5、GM130、NBR1和过氧化物酶体等蛋白和（或）细胞器构成；ATG5、ATG7、ATG10、ATG16L1和RB1CC1等自噬相关基因突变可能参与介导了自噬缺陷和胞质嗜酸性包涵体形成。