DROOPING LEAF基因的C2H2和YABBY结构域在水稻发育过程中的作用

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YABBY基因家族是种子植物中特有的一类基因。YABBY基因编码转录因子,参与调控植物发育过程的诸多方面。Drooping leaf(DL)是水稻YABBY基因家族的一员,其编码的蛋白N端具有保守的锌指结构域C2H2,C端具有保守的YABBY结构域。DL基因参与调控了水稻叶片中脉的形成以及心皮的发育。目前我们仍不清楚DL基因调控中脉形成以及心皮发育的分子机制。  本论文以一系列水稻dl突变体为材料,通过分析C2H2和YABBY结构域与表型的关系来阐明DL基因参与调控水稻叶片中脉发育以及育性的分子机制,结果如下:  1.通过分析一系列dl突变体突变位点及其表型我们发现,无论是C2H2结构域还是YABBY结构域,出现突变都会同时影响中脉的发育和育性,暗示C2H2结构域和YABBY结构域可能协同参与对下游基因的调控,从而影响了以上两种表型。  2.我们通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验,分别从体外和体内证明了DL的C2H2和YABBY结构域可以互作。  3.我们发现dl突变体的C2H2结构域和YABBY结构域不能产生互作,说明dl突变体的突变位点就是C2H2结构域和YABBY结构域互作的关键位点,从而找到了两个结构域互作的关键位点C18、V26和E118;我们还比对了一系列有无中脉的禾本科植物的DL直源基因的氨基酸序列,找到了C2H2和YABBY结构域互作的另一个关键位点N162。  4.我们用构建的Ubi∷FLA G-C2H2载体转化dl突变体nq2和nq14,发现不能互补nq2和nq14的突变表型。半体内的Pull-down实验证明外源的C2H2结构域不能与DL的YABBY结构域互作,可能是因为空间位阻的原因。  5.利用CRISPR/Cas9系统敲除DL基因后我们得到水稻dl-cy(dl-crispryabby),dl-cy在YABBY结构域有突变,致使其编码蛋白的一个精氨酸缺失,但不影响与C2H2结构域的互作,并且dl-cy也呈现正常表型。  6.DL基因能结合CTCTGTTT基序,而突变的DL基因不能结合该序列。根据已报道的DL芯片数据,OsEIL1可能位于DL基因下游。我们发现OsEIL1的启动子区域含有CTCTGTTT基序,并且DL能结合OsEIL1的启动子区域。我们认为OsEIL1可能是DL的靶基因之一。  我们的研究结果表明,DL的C2H2结构域和YABBY结构域的互作与披叶以及育性受影响的性状相关,C2H2结构域和YABBY结构域通过互作来协同参与对下游基因的调控,这种互作应该是DL正常行使功能所必须的。
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