胶质瘤起源于神经胶质细胞，是最常见的颅内原发肿瘤。近三十年，胶质瘤的发病率逐年增高，且随着年龄的增长发病率呈上升趋势。尽管随着影像技术、手术、放疗、化疗和靶向治疗等各种治疗手段的发展，多学科综合治疗的实施，胶质瘤的2年生存率由10.4％提高到26.5％，胶质瘤的总体治疗效果仍欠佳，目前成人的高级别胶质瘤1年和5年生存率仍仅为30％和13％。胶质瘤细胞有着复杂的基因突变、表达异常的遗传背景，胶质瘤的治疗抵抗、易复发可能与其导致的肿瘤细胞间广泛的异质性相关。因此，对胶质瘤细胞发生、发展相关调控分子机制的研究既可促进对其生物学行为的深入理解，又能为不同的治疗新策略提供理论基础。　　表皮生长因子(EGFR)在胶质瘤发生发展中起到了重要作用，其高表达能促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，并能抑制肿瘤细胞凋亡，同时还能够促使肿瘤组织中的血管生成。EGFRvⅢ是最常见的EGFR突变，在40％的胶质瘤中表达，但不存在于人体正常组织中。EGFRvⅢ相关酶活性是导致信号传导通路失调及细胞周期阻滞的关键因素。　　中心体相关蛋白55(CEP55)是新近发现的有丝分裂磷蛋白，在细胞的胞质分裂中起着重要作用。CEP55的过表达将造成细胞有丝分裂的缺陷，导致不稳定的多核细胞出现，并增强细胞的迁移和侵袭能力。最近的研究证实，在人结肠癌、乳腺癌、肺癌有着CEP55的高表达，而CEP55的异常表达与这些肿瘤的发生和不良预后密切相关。目前对于人胶质瘤细胞中CEP55表达情况及其在胶质瘤细胞中的具体作用还知之甚少。　　研究目的：　　1.明确CEP55在胶质瘤中与正常人脑组织中的表达差异　　2.研究CEP55对人胶质瘤细胞系U251细胞增殖的影响　　3.探讨EGFRvⅢ对CEP55的作用　　4.动物模型验证EGFRvⅢ及CEP55对胶质瘤进展的作用　　研究方法：　　1.胶质瘤组织及正常人脑组织中CEP55的表达　　1.1Western-blot方法检测胶质瘤组织及正常人脑组织中CEP55蛋白的表达　　将组织充分研磨后使其溶于PIPA与PMSF的混合溶液中，离心取上清，应用SDS-PAGE凝胶系统将蛋白分离。转印至PVDF膜后封闭，一抗标记，4℃冰箱过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时，化学发光显影得到相应条带。　　1.2qPCR方法检测胶质瘤组织及正常人脑组织中CEP55基因的表达　　提取40例人脑胶质瘤组织标本及10例正常脑组织标本中的总RNA，通过逆转录为cRNA，采用qPCR方法检测组织中CEP55的表达情况　　1.3利用Firebrows分析来自TCGA的数据，分析CEP55表达与胶质瘤病人生存率的相关性。　　2.CEP55对人胶质瘤细胞系U251细胞增殖作用的研究　　2.1qPCR及Western-blot检测CEP55在人脑胶质瘤细胞株中的表达　　半定量检测CEP55基因的mRNA及蛋白表达水平，研究CEP55在人胶质瘤细胞株中的表达情况。　　2.2CEP55RNA干扰慢病毒载体的转染　　CEP55干扰病毒购自中国上海吉凯基因公司，CEP55-siRNA序列为5-GTGGGAAAGGAAAGCTGAC-3。建立稳定转染慢病毒的U251细胞系。　　2.3qPCR及Western-blot检测CEP55沉默效率　　运用CEP55RNAi转染U251细胞系后，经过毒性嘌呤霉素筛选后收集细胞，采用qPCR方法检测CEP55mRNA的沉默效率，同时采用Western-blot方法检测其蛋白的沉默效率。　　2.4CCK-8以及Edu测定转染后的U251细胞增殖情况　　转染组、未转染组以及对照组各组细胞以3000个/孔接种于96孔板中，常规培养，每3d换液，CCK-8细胞增殖分析试剂盒测定细胞增殖曲线。Edu检测:各组细胞按照每孔2×105/孔接种于6孔板内，加培养液37℃过夜孵育后，每孔按照2μl Edu/1ml培养液分别加入Edu，37℃孵育6个小时。按照试剂盒说明处理细胞，流式细胞仪分析。　　3.EGFRvⅢ对CEP55的作用研究　　3.1构建高表达EGFRvⅢ的U251细胞　　高表达EGFRvⅢ的病毒载体购自中国上海吉凯基因公司。U251细胞按照转染组，对照组，未转染组三个组别分别感染相应慢病毒。感染3天后在荧光显微镜下观察转染情况，经过筛选，传代后收集细胞。　　3.2Western-blot及qPCR检测转染效果　　分别以免疫蛋白印迹法中X线显影中条带灰度值以及qPCR结果中2-△△CT为比较值，检测U251细胞高表达EGFRvⅢ的转染效率。　　3.3CCK-8技术检测高表达EGFRvⅢ的U251细胞的增殖能力　　3.4Western-blot及qPCR检测高表达EGFRvⅢ的U251细胞中CEP55的表达水平　　3.5构建高表达EGFRvⅢ同时低表达CEP55的U251细胞模型，通过CCK-8及Edu技术检测该模型U251细胞的增殖情况　　4.EGFRvⅢ及CEP55对胶质瘤进展的作用研究　　4.1实验动物分组　　将同一批次购买的无胸腺裸鼠25只，随机分为沉默CEP55组、转染阴性病毒组，过表达EGFRvⅢ组，沉默CEP55的高表达EGFRvⅢ组，未转染慢病毒组共5组，每组5只，分笼饲养。　　4.2各组的U251细胞培养　　各组细胞在体外培养，并制备成细胞悬液　　4.3裸鼠皮下成瘤模型的建立　　将五组细胞分别于皮下注入之前分好组的裸鼠皮下，按照相同饲养条件饲养。　　4.4肿瘤的体积的测定　　按照裸鼠皮下注射细胞悬液第7天开始，肿瘤的长短径每隔两天记录一次，共24天。第24天观察期结束，处死裸鼠，切除各组裸鼠皮下肿瘤，测量肿瘤大小。　　研究结果：　　1.胶质瘤组织及正常人脑组织中CEP55的表达　　1.1Western-blot结果显示，与正常人脑组织相比，CEP55在胶质瘤中高表达，但同脑胶质瘤的病理级别无明显关系。　　1.2qPCR结果显示，CEP55在胶质瘤组织中的表达较正常脑组织明显升高，无论是在低级别还是高级别皆增高。但在低级别与高级别之间，CEP55的表达无显著差异。　　1.3CEP55的表达量越高，胶质瘤患者生存期越低。　　2.CEP55对人胶质瘤细胞系U251细胞增殖作用的研究　　2.1Western-blot和qPCR结果显示CEP55在胶质瘤细胞株U251中高表达　　2.2Western-blot结果显示，相比对照组以及未转染组，转染组CEP55蛋白表达量明显降低;qPCR检测结果显示转染组CEP55mRNA表达量下降大于95％。两种方法均表明转染效果达到理想水平。　　2.3CCK-8结果显示从第二天开始阴性对照组以及未转染组增殖速率明显快于转染组;4天后转染组增殖曲线开始下降，而阴性对照以及未转染组增殖正常。流式细胞术分析Edu结果显示转染组增殖细胞比例显著低于阴性对照组和空白组。　　3.EGFRvⅢ对CEP55的作用研究　　3.1成功转染高表达EGFRvⅢ的慢病毒载体，实现其在U251细胞株中的稳定高表达。并在蛋白及基因两个方面检测到利用慢病毒转染技术能够实现EGFRvⅢ基因在U251细胞株中的高表达。　　3.2CCK-8结果显示从第二天开始，高表达EGFRvⅢ的U251细胞较对照组及未转染组增殖能力明显增强，第五天达到峰值。　　3.3蛋白以及mRNA层面检测，结果显示高表达EGFRvⅢ的U251细胞中CEP55表达水平显著高于阴性对照组及未转染组。　　3.4利用RNAi技术将高表达EGFRvⅢ的U251细胞敲低CEP55基因的表达量。利用CCK-8及Edu技术检测，结果表明高表达EGFRvⅢ的U251细胞敲低CEP55后增殖效率明显降低。　　4.EGFRvⅢ及CEP55对胶质瘤进展的作用研究　　LV-EGFRvⅢ组、NC组以及control组肿瘤生长较CEP55RNAi-LV组以及si-CEP55组明显增快。　　研究结论：　　1.CEP55在人胶质瘤组织中表达量显著高于正常组织。　　2.CEP55表达量越高，患者生存期越低。　　3.CEP55在人胶质瘤细胞株U251细胞中高表达;CEP55显著增强U251细胞的增殖能力。　　4.EGFRvⅢ可能为CEP55的上游信号通路。　　5.EGFRvⅢ通过上调CEP55表达，从而增强U251细胞的增殖能力，进而促进胶质瘤进展。　　6.CEP55可以作为胶质瘤治疗的新靶点。　　意义：　　本文发现CEP55在人胶质瘤中高表达。CEP55的高表达通过增强胶质瘤细胞的增殖能力而促进胶质瘤进展。此外，本文还首次发现EGFRvⅢ可能是CEP55的上游信号通路。这一研究结果补充了胶质瘤发展的机制，并为胶质瘤的治疗提供了理论依据及治疗靶点。