BCLAF1/MED23抑制非小细胞肺癌细胞早熟性衰亡的分子机制

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:a306783805
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:Mediator complex(MED复合物)是一种多亚基的复合物,通过与转录因子之间的特定相互作用控制着广泛的生理功能,包括增殖、分化和肿瘤发生。MED23作为MED复合物的亚基之一,以往的研究结果发现MED23参与食道鳞状细胞癌和肺癌的发生。多种肿瘤细胞中均有自噬活性的改变,肿瘤的自噬活性由肿瘤的类型、微环境、特定基因以及信号通路共同决定。目前,在肿瘤中关于MED23的分子调节机制的研究还少有报道,而且MED23在肿瘤中是否参与自噬的调控还未有报道。因此本项研究的目的是在肺癌中探究MED23参与细胞自噬调控途径诱导细胞发生早熟性衰亡的分子机制以及其临床应用价值。此项研究将丰富人们对肺癌中自噬调控机制的认识,希望能为临床治疗提供新的理论依据。方法:本研究由三部分组成。第一部分:MED23在肺癌的表达以及对肿瘤自噬的影响。利用肺癌组织芯片,通过免疫组织化学染色来分析MED23在肺癌组织之间的表达规律以及与患者生存期之间的关系。利用蛋白免疫印迹实验在肿瘤细胞系中验证MED23的差异性表达。利用慢病毒介导的sh RNA来下调MED23的表达,通过Western blot实验检测自噬相关标记蛋白SQSTM1和LC3B-II的变化,同时利用自噬抑制剂Baf A1或自噬激活剂Torin处理细胞来再次确定MED23所引起的自噬相关标记蛋白的改变。利用转染质粒GFP-LC3-RFP-LC3ΔG实验监控肺癌细胞下调MED23后所引起的自噬流的改变,然后通过β-gal实验检测下调MED23之后肺癌细胞所产生的生物学功能变化。第二部分:MED23干预自噬途径诱导肺癌细胞发生早熟性衰亡的机制。在肺癌细胞系A549中稳定过表达带有Flag标签的MED23,经免疫沉淀质谱鉴定分析MED23的相互作用蛋白BCLAF1。通过Co-IP和Duolink方法验证BCLAF1与MED23之间的相互作用。利用慢病毒介导的sh RNA下调BCLAF1后检测自噬流的变化。结合β-gal实验检测下调BCLAF1之后肺癌细胞所产生的生物学功能变化。第三部分:提取肺癌细胞系A549shcon和稳定下调BCLAF1的细胞系A549sh BCLAF1的总RNA,进行转录组测序,利用生物信息学分析寻找差异表达的基因以及BCLAF1潜在的下游基因。通过Ch IP和Luciferase实验来证实NUPR1是转录因子BCLAF1的靶基因。将AAV介导的NUPR1 sh RNA病毒和Trifluoperazine(TFP)联合应用,观察裸鼠体内肿瘤的发展变化,以此来证明AAV介导的NUPR1下调与TFP联合使用能够削弱肺癌细胞体内的增殖能力。结果:第一部分研究结果显示:在人肺癌组织芯片中的IHC结果表明与正常的癌旁组织相比,MED23在肺癌患者的癌组织中表达显著增高,而且MED23表达水平低的肺癌患者比表达水平高的患者具有更长的生存期。MED23在多种肿瘤细胞系中的表达具有显著的差异性。Western blot实验检测下调MED23的肺癌细胞中自噬的标记蛋白结果表明自噬被抑制。监测细胞自噬流量变化的GFP-LC3-RFP-LC3ΔG实验进一步确认了此实验结论。β半乳糖苷酶染色实验结果显示下调MED23的肺癌细胞出现早熟性衰亡。第二部分研究结果显示:在肺癌细胞系A549中稳定过表达带有Flag标签的MED23,质谱鉴定、PLA实验和免疫共沉淀实验结果发现MED23结合转录因子BCLAF1。在肺癌中通过慢病毒介导的sh RNA下调BCLAF1导致肺癌细胞中的自噬流量减少,自噬被抑制。同时结合β-gal实验检测肺癌细胞所产生的生物学功能变化,发现BCLAF1下调能够诱导肺癌细胞发生早熟性衰亡现象,与下调MED23相似。第三部分研究结果显示:RNA-seq测序分析发现与对照组细胞相比下调BCLAF1的A549细胞中自噬溶酶体相关途径的许多基因表达有显著差异。通过RT-PCR实验、Ch IP实验和荧光素酶报告基因检测实验发现NUPR1是BCLAF1的靶基因。通过AAV介导的NUPR1 sh RNA病毒和TFP联合应用,观察裸鼠体内肿瘤的发展变化,发现AAV介导的NUPR1下调与TFP联合应用削弱裸鼠体内肺癌细胞的增殖。
其他文献
目的:旨在通过分析大样本数据中甲状腺乳头状癌(PTC)诊断年龄与原发灶大小和颈部淋巴结转移(LNM)之间的关系,对比外周血、颈部淋巴结和肿瘤组织的T细胞受体(TCR)组成,预测并
背景与目的:阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)是导致临床侵袭性真菌感染最常见的致病真菌之一。由于肿瘤、艾滋病等患者的增加,抗真菌药物的滥用,免疫抑制剂的
This study investigated the effects of path-goal theory(PGT)principal leadership styles on teacher job performance in private secondary schools.It was conducted
企业发生危机后不但自身会受到重创,其影响还会波及行业内其他企业,产生企业危机负面“溢出效应”(Spillover of Negative Impacts)。2008年的“三聚氰胺事件”、2011年的“7
【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是脊柱外科最严重的创伤性疾病之一,具有高发病率、高致残性、低死亡率、修复困难的特点。本研究旨在通过体外SH-SY5Y细胞的氧化应激
随着地下矿产资源的大面积开采,矿区地表沉降监测和治理问题成为近年来的研究热点问题。煤炭从地下开采出来后会形成采空区,持续高效地监测采空区上方地表的沉降,可以了解地
线粒体对众多的细胞进程至关重要,包括能量代谢、细胞程序性死亡、氨基酸生物合成、蛋白质质量控制和降解等。大多数的线粒体蛋白需要在胞质中合成,然后通过特异性蛋白转位酶
近代化的地方自治制度对于日本而言,虽然是一项自普鲁士移植而来的“舶来品”,但却在近现代日本的法治化进程中发挥了至关重要的作用。从法治化与地方自治的相互关系来看,两
在中国交通运输快速发展的背景下,隧道已成为交通基础设施不可或缺的一部分,隧道建设在全国各地尤其是西部地区如火如荼地开展起来。岩石、混凝土是隧道建设中涉及的两种主要
世界人口的持续增长和气候变化的不断加剧,导致粮食问题日益严峻。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,近年来通过品种改良或优化栽培措施来实现产量的提升已达到了上限。光合