论文部分内容阅读
多发性硬化（multiple sclerosis,MS）通常被认为是一种T细胞介导的中枢神经系统（central nervous system,CNS）自身免疫性疾病。激活的T细胞由外周浸润CNS,分泌促炎因子激活巨噬细胞和小胶质细胞,扩大炎症反应。然而T细胞和巨噬细胞又因其表型功能不同而分成促炎型和抗炎型,因此调节T细胞与巨噬细胞表型,维持CNS微环境的稳定是治疗MS的重要分子机制。银杏内酯A（Ginkgolide A,GA）在多种炎症和免疫疾病的研究中,其抗炎作用得以证实。本研究以MS经典动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠为对象,通过体内和体外实验探讨GA治疗EAE的潜力以及对T细胞和巨噬细胞的调控作用与机制。第一部分银杏内酯A治疗EAE的免疫调节机制的探究目的:明确GA治疗EAE的疗效,探讨GA对T细胞和巨噬细胞的免疫调控作用。方法:将42只雌性C57BL/6小鼠按体重随机分成正常/生理盐水（normal saline,NS）组、EAE对照组和GA治疗组,各14只。用MOG35-55多肽免疫EAE组和GA组小鼠,制备EAE模型。各组于免疫后第10天至第27天灌胃给药,NS组和EAE组作为对照,给予生理盐水,GA治疗组给予GA,每天记录各组小鼠的体重和临床症状变化。免疫后第28天处死小鼠,取各组4只小鼠脊髓,用4%多聚甲醛固定,包埋冻存后做冰冻切片行HE和LFB染色。各组取5只小鼠的脾脏,无菌下制备成单个核细胞悬液,计数后一部分用CD4+和CD11b+抗体标记后于流式细胞仪上分析T细胞和巨噬细胞表型的变化。另一部分各组细胞悬液培育在完全培养液中,放置在37°C二氧化碳培养箱,孵育48h后用ELISA法测定细胞因子的水平。最后各组5只小鼠提取脊髓蛋白,用Western blot检测巨噬细胞的标记物以及炎性信号通路的表达。以上数据用Graphpad Prism分析处理。结果:1.GA有效延迟了EAE小鼠的平均发病时间,降低了EAE小鼠的最高临床评分。此外对比EAE对照组,GA能够缓解EAE的症状严重程度,减少体重下降程度。2.病理学检查下,EAE小鼠的脊髓中可见大量炎性细胞的浸润,在GA治疗后可有效减少炎性细胞浸润程度（P<0.05）。脊髓白质区的髓鞘脱失也是EAE小鼠的重要病理特征,GA治疗后显著减轻了髓鞘脱失情况（P<0.001）。3.GA调节了外周T细胞亚群Th1/Th17和Th2/Tregs的平衡,减轻了EAE炎症反应的扩大。对比EAE组,GA抑制了表达IL-17和IFN-γ的CD4+T细胞亚群（P<0.05）,上调了CD4+TGF-β+和CD4+IL-10+T细胞亚群的百分比（P<0.0001）。4.GA促使巨噬细胞M1向M2型极化。流式结果表明与EAE组相比,GA组能有效抑制外周M1巨噬细胞亚群CD8a（P<0.0001）、CD16/32（P<0.0001）、CD40（P<0.0001）、IL-12（P<0.01）的表达。相反GA组促使M2巨噬细胞亚群中IL-10和CD206表达增加（P<0.01,P<0.001）。此外GA抑制了脊髓中巨噬细胞M1型标记物的COX-2的表达（P<0.05）,显著增高M2型标记物Arg-1的表达（P<0.001）,而对iNOS无明显抑制。5.经GA干预后,脊髓中炎性信号通路的表达受到抑制,细胞因子的释放也受到调节。GA抑制了TLR-2,MyD88,JNK（均P<0.05）和NF-κB（P<0.01）炎性信号通路,下调了促炎因子TNF-α和IL-1β的水平（P<0.001）,而抗炎因子IL-4水平得以增高（P<0.01）。结论:GA可减轻EAE症状的严重程度,有效减少脊髓脱髓鞘,抑制炎性细胞浸润。其作用机制与调节M1/M2巨噬细胞和Th1/Th17和Th2/Tregs T细胞亚群在EAE发展中的失衡密切相关。GA通过调节T细胞各亚群的稳定,减少外周免疫细胞向CNS中的炎性浸润,减轻炎症反应的进一步扩大。GA抑制炎性信号通路促使巨噬细胞M1向M2的极化,有效改善了炎性微环境。天然产物GA通过外周免疫调节和改善中枢炎性微环境,展现其治疗EAE的潜力。第二部分银杏内酯A改善体外巨噬细胞的炎症反应目的:探讨GA在体外实验中,对MOG35-55诱导的EAE小鼠的巨噬细胞表型的影响。方法:免疫20只雌性C57BL/6小鼠,于免疫第9天无菌取脾,制备成单个核细胞悬液,用CD11b磁珠分选出巨噬细胞,计数后分2组DMSO和GA组,分别加DMSO和GA于37°C培养箱孵育72h。收取巨噬细胞在流式细胞仪上分析其表型变化,另取上清液用ELISA法测定细胞因子IFN-γ,IL-17,IL-4,IL-6,IL-10,TNF-α和IL-1β的水平。结果:结果表明,GA降低了M1标记物CD8a（P<0.0001）,CCR7（P<0.0001）,CD11c（P<0.01）,CD40（P<0.0001）和MHC（P<0.0001）,增加了M2标记物CD206（P<0.01）和CD200（P<0.01）的表达。此外,GA抑制炎性因子IL-1β（P<0.05）,IL-17（P<0.05）和TNF-α（P<0.05）的水平,但增高了抗炎因子IL-4的水平（P<0.05）。结论:GA可体外修饰EAE巨噬细胞发挥免疫调节作用,GA促使巨噬细胞M1向M2极化,调节其细胞因子分泌水平。