论文部分内容阅读
[目的]研制和初步评价ATRX-C抗体;分析ATRX蛋白在THP-1细胞中的定位及ATRX在人乳头瘤病毒16型(HPV16)阳性宫颈癌组织中的表达和定位,为深入探讨ATRX蛋白在HPV16所致宫颈癌中的作用及机制奠定基础。[方法]设计ATRX C端基因片段(2193-2492氨基酸)引物,利用PCR扩增目的片段,双酶切后连接表达载体p ET30a,经PCR、酶切、测序分析,构建原核表达载体p ET30a/ATRX-C2193-2492;将质粒p ET30a/ATRX-C2193-2492转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,利用镍离子亲和层析法纯化6His-ATRX-C2193-2492蛋白,利用Western blot检测纯化产物6His-ATRX-C2193-2492;将纯化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白以皮下多点注射和腹腔注射方式免疫接种6只8周龄雌性BALB/c小鼠。初次免疫3周后,再免疫1次;第4、5周后分别再加强1次,共免疫接种4次。每次免疫前及末次免疫后7天取血,ELISA测定抗体效价。饱和硫酸铵盐析沉淀法初步纯化抗血清,并用Western blot检测之;利用间接免疫荧光检测Daxx和ATRX在THP-1细胞株中的分布与定位;收集正常宫颈组织细胞、HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)、原位癌和浸润型宫颈癌组织标本,通过免疫组化技术检测宫颈组织中ATRX的分布和定位以及表达量;利用Western blot检测正常宫颈组织,HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)、原位癌和浸润型宫颈癌组织细胞中ATRX的表达量。[结果]经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建p ET30a/ATRX-C2193-2492原核表达载体;表达载体p ET30a/ATRX-C2193-2492在E.coli中诱导表达分子量约34k Da产物,且该产物能与ATRX抗体发生反应,并且纯化得到目的产物;利用纯化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫小鼠,制备的抗ATRX-C2193-2492多克隆抗体,其效价为1:12800;在THP-1细胞中,ATRX显绿色信号和Daxx显红色信号,两种信号都定位于细胞核,融合时出现黄色信号;ATRX在正常宫颈组织细胞具有较高表达并主要定位在细胞核;在HPV16阳性的宫颈上皮内瘤变(CIN)组织细胞的表达与正常细胞类似;在原位癌组织细胞中表达量姣CIN中减低,主要定位在细胞核和细胞浆;在浸润型宫颈癌组织细胞中表达量降低,主要定位在细胞浆,细胞核中表达量明显减少。[结论]制备的ATRX-C2193-2492抗血清可用于检测组织和细胞中的ATRX蛋白;ATRX蛋白在THP-1细胞核和正常宫颈组织细胞中大量表达;在HPV16阳性所致的宫颈癌进程中,其表达量可能逐渐减少。