背景食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率高、恶性程度高、致死率高、预后差是其主要特征。我国位于国际著名的“食管癌带”上，发病率位于世界首位。由于食管癌起病隐匿，临床特征不明显，确诊时往往已到中晚期，术后复发率高，导致5年生存率远低于其他肿瘤。因此，食管癌的早期诊断亟待新的进展。食管癌是遗传因素和环境因素共同作用导致的复杂疾病。食管癌从组织分型看，主要包括食管鳞状细胞癌和食管腺细胞癌，欧美以食管腺细胞癌多见，而我国以食管鳞癌为主，占食管癌患者的90%以上。发病类型上的差异说明遗传因素对我国食管鳞癌高发起了重要作用。因此，从遗传因素寻找食管鳞癌的早期诊断指标具有重要意义。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）是DNA序列中单个核苷酸碱基的变异，是基因组中最常见的遗传变异。由于稳定的可遗传性和与疾病的相关性，SNPs成为研究复杂疾病理想的遗传标记之一。基于SNP的疾病关联研究主要有两种策略：候选基因SNP关联分析和全基因组关联研究（Genome-Wide Associated Study，GWAS）。两种策略各有利弊，候选基因SNP关联分析必须假定致病基因，且筛选范围局限；而GWAS规模巨大，需要大量的人力和物力，而且筛选到的阳性SNPs不易阐述其功能。因此，如何选择与疾病相关的SNPs进行关联分析，成为疾病遗传易感性研究的关键问题。SNPs在基因组分布广泛，根据其在基因组中发生位置不同，分为基因间SNPs、基因编码区SNPs、基因非编码区SNPs。其中，位于基因调控区域的基因非编码区SNPs，可以影响基因的转录或者转录后调控，称为调控SNPs。基因组范围内，转录因子结合区域SNPs是重要的调控SNPs，这些SNPs可能影响转录因子与靶基因的结合，从而调控基因的表达，成为SNPs研究的热点。筛选转录因子结合区域SNPs作为遗传标记，后期更容易阐明这些SNPs的功能及其与疾病关系。P53是迄今为止发现的最为重要的肿瘤抑制因子之一，通过维持基因组稳定性、介导细胞凋亡、抑制血管生成等途径来避免机体肿瘤的发生。而P53种种抑癌活性的产生，是以其作为转录因子调控的众多下游靶基因发挥作用为基础的。如P53可以通过上调Bax的表达水平，同时下调Bcl-2的表达来促进细胞凋亡的发生；当细胞受到应激时，P53通过调控靶基因CDKN1A和GADD45A的表达，发挥细胞周期阻滞和基因组修复的功能。我们推测，P53与下游靶基因的结合调控区域出现的单核苷酸多态性位点（SNPs），不同等位基因与P53的结合活力可能存在差异，从而引起靶基因的表达水平不同，最终导致携带不同等位基因的个体对于肿瘤具有不同程度的易感性。因此，这些P53结合区域的SNPs有望成为新的肿瘤发病风险标记，为肿瘤的早期诊断提供靶标。目的本研究拟通过生物信息学挖掘，在基因组范围内筛选转录因子P53结合区域内中国汉族人群存在的SNPs位点，进一步以SNPs所在基因功能为筛选标准，得到P53结合区域内与肿瘤发生有关的SNPs；以重庆人群为对象，通过病例-对照研究，探究这些SNPs与食管鳞癌易感性的关系，并于后期拟对阳性SNPs位点进行功能研究，从而为食管鳞癌的早期诊断提供理论依据。方法与结果1、研究对象的筛选研究对象来自第三军医大学第一附属医院胸心外科住院治疗的食管鳞癌患者和同期体检人员，病例和对照均为长期居住于重庆地区的汉族人群，两组在年龄、性别等人口学特征方面完全匹配，且不存在血缘关系。病例和对照各选择400例进行基因分型。2、SNPs位点的筛选从UCSC数据库中筛选转录因子P53全基因组范围内的的结合序列及包含的SNPs位点12301个，然后结合HapMap数据库筛选P53结合区域内中国北京汉族人群中存在的SNPs位点2688个，并且成立拟研究的SNP库。在Gene Ontology数据库中筛选与肿瘤发生有关的基因，结合既往研究发现Bax、CDKN1A、GADD45A基因是P53的靶基因，且与肿瘤发生相关，因此，我们从SNP库中重点筛选这三个基因座位内的SNPs，在HapMap数据库查找它们在中国汉族人群中的等位基因型频率，把MAF≥5%的SNPs作为拟研究的SNPs。得到如下6个SNPs：rs1009316，rs3783468，rs681673，rs532446，rs762624，rs2395655。3、SNaPshot分型及HWE本研究采取多重SNaPshot方法对rs1009316，rs3783468，rs681673，rs532446，rs762624，rs2395655等6个SNPs位点在400例病例及400例对照中进行基因分型，由于分型成功率与各SNPs位点的PCR效率及实验操作误差有关，最后成功进行分型的例数为病例331-390例，对照367-384例。采用哈代-温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE）检验，我们发现rs3783468、rs681673、rs532446三个SNPs位点不符合HWE，不再进行进一步的关联分析，而rs1009316、rs762624、rs2395655三个SNPs位点检验p值分别为0.240、0.258、0.297，均通过了HWE。4、rs1009316、rs762624、rs2395655在病例和对照中的基因型分布成功对rs1009316进行基因分型的病例为331例、对照为367例。其中病例中CC、CT、TT基因型分别为235例（71.0%）、96例（29.0%）、0例；对照中CC、CT、TT分别为304例（82.8%）、63例（17.2%）、1例。rs762624相对rs1009316成功分型样本较多，病例和对照中CC、AC、AA分别为97例（26.9%）、204例（56.7%）、59例（16.4%）和143例（38.2%）、168例（44.9%）、63例（16.9%）。rs2395655在病例和对照中GG、AG、AA分别为141例（39.7%）、161例（45.4%）、53例（14.9%）和113例（31.5%）、168例（46.8%）、78例（21.7%）。5、rs1009316、rs762624、rs2395655与食管鳞癌的关联作用在共显性、显性、隐性、乘法、和超显性5种遗传模型下，分析rs1009316、rs762624、rs2395655与食管鳞癌发病风险的关系。rs1009316在除了显性模型外的4种遗传模型中均显示与食管鳞癌的发病风险具有明显相关性，CC相对CT（共显性模型）、CC相对CT+TT（隐性模型）、C相对T（乘法模型）均降低食管鳞癌的发病风险（OR值和95%CI分别为0.499，0.348-0.717；0.507，0.354-0.728；0.563，0.403-0.788），在超显性模型中，CT相对CC+TT增加食管鳞癌的发病风险（OR值为2.010，95%CI为1.400-2.886），由于TT样本几乎为零，故可简化为CT与CC的比较结果。rs762624在共显性（OR（CC/AC）为0.559，95%CI为0.402-0.776）、隐性（OR为0.596，95%CI为0.436-0.814）、乘法（OR为0.800，95%CI为0.650-0.985）、和超显性模型（OR为1.603，95%CI为1.198-2.146）中均与食管鳞癌的发病风险相关联，但在显性模型中不存在这种关联性（OR为1.033，95%CI为0.701-1.525）。rs2395655在超显性模型中p值为0.699，与食管鳞癌易感性不存在关联作用。在共显性、显性、隐性、乘法中与食管鳞癌发病风险相关（p值分别为0.005、0.019、0.021、0.004），其中在乘法模型中p值最小，且G等位基因相比A等位基因增加样本对食管鳞癌的发病风险（OR值为1.364，95%CI为1.104-1.685）。6、根据吸烟史对阳性位点进行分层分析rs1009316在无吸烟史和有吸烟史样本中，C等位基因相对T等位基因均表现出保护效应，p值为0.005和0.008，OR值和95%CI分别为0.516(0.324-0.819)和0.484(0.282-0.833)；而rs762624的C等位基因仅在无吸烟史的样本中降低食管鳞癌的发病风险（OR值为0.696，95%CI为0.503-0.962）。对于rs2395655位点，在有吸烟史样本中，G等位基因显著增加样本的食管鳞癌易感性（OR值为2.341，95%CI为1.728-3.172)。结论1、综合各种遗传模型统计推断结果，rs1009316的CC基因型是保护因素，C等位基因相比T等位基因降低食管鳞癌的发病风险。2、rs762624的CC基因型是食管鳞癌的保护因素，但其C等位基因仅在无吸烟史的样本中降低食管鳞癌的发病风险。3、rs2395655与食管鳞癌易感性相关性，在有吸烟史的样本中，G等位基因是食管鳞癌的危险因素。