背景和目的旋毛虫病是世界范围内广泛存在的一种人兽共患病,对人类公共健康造成严重威胁,同时也产生较为严重的经济问题。旋毛虫病主要是因生食或半生食含有活幼虫囊包的猪肉、其它动物肉类及肉制品引起的。多种丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP）在寄生虫中已经被鉴定出来,这些丝氨酸蛋白酶与寄生虫的发育和营养、侵入组织和细胞、凝血及免疫逃避等有关。SP超家族其C端含有His、Asp及Ser活性位点的结构域在食物消化、细胞凋亡与分化、组织重构、免疫防御过程中发挥重要作用,有可能作为寄生虫病诊断抗原和免疫保护的候选分子,同时,也有可能作为治疗药物的候选标靶。本课题组前期在旋毛虫肌幼虫表面蛋白中,鉴定出了一种旋毛虫丝氨酸蛋白酶（TsSP1.1,Gen Bank:ACA28930.1）,本文对TsSP1.1进行了克隆表达,并对TsSP1.1的生物学特性及其在幼虫侵入肠上皮细胞（IECs）中的作用进行了研究。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物、细胞、质粒、菌种本实验使用的旋毛虫虫种为本实验室保种的旋毛虫（T1）。实验所用动物为购自河南省动物实验中心的昆明小鼠。实验用小鼠小肠上皮细胞（IEC）是本实验室早期分离后传代保存的。克隆和表达菌是大肠杆菌BL21,克隆载体是p MD19-T,表达载体是p QE-80L。2.旋毛虫丝氨酸蛋白酶的生物学分析利用NCBI在线网站预测TsSP1.1（Gen Bank:ACA28930.1）的结构域和酶活性位点。用Bio Edit软件将TsSP1.1与其他寄生虫、小鼠和人等11个物种的丝氨酸蛋白酶的序列进行比对,用MEGA7的邻接法构建TsSP1.1的系统发育进化树。3.TsSP1.1的克隆表达及其抗原性分析根据蛋白酶基因序列设计引物,以旋毛虫肌幼虫c DNA为模板进行PCR扩增,将扩增后的TsSP1.1基因连接到克隆载体p MD19-T上,双酶切之后再将其与表达载体p QE-80L连接,构建重组表达质粒p QE-80L/TsSP1.1。将镍柱纯化后的rTsSP1.1免疫小鼠制备抗rTsSP1.1血清。利用western blot技术进行rTsSP1.1的抗原性分析。4.TsSP1.1在旋毛虫各个虫期的表达及定位收集旋毛虫肌幼虫（ML）、肠道感染性幼虫（IIL）、成虫（AW）及新生幼虫（NBL）,制备旋毛虫不同虫期虫体可溶性抗原,经western blot分析TsSP1.1在不同虫期的表达。应用间接免疫荧光技术（IIF）观察TsSP1.1在旋毛虫的不同虫期的表达及在虫体组织的定位。5.rTsSP1.1酶活性测定丝氨酸蛋白酶具有催化底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）水解产生BA的能力,BAEE的光吸收峰值波长为253 nm处吸光值的变化。通过测定不同温度、不同p H值反应的OD253值,观察rTsSP1.1酶反应的最佳温度、p H值对酶活性的影响。此外,将复性后的rTsSP1.1蛋白进行基质凝胶电泳（明胶酶谱法分析）,检测其酶活性。6.rTsSP1.1与IECs的结合及其在旋毛虫侵入IECs中的作用通过Western blot技术证明rTsSP1.1与IECs的结合作用。将rTsSP1.1与旋毛虫肠道感染性幼虫（IIL）接种至IEC单层,观察rTsSP1.1在旋毛虫侵入IECs中的作用。将抗rTsSP1.1血清与IIL同时接种至IEC单层,用旋毛虫感染小鼠血清为阳性对照、鼠正常血清为阴性对照,观察特异性抗rTsSP抗体封闭对IIL侵入IECs的阻断作用。7.抗rTsSP抗体对旋毛虫侵入肠黏膜阻断作用的动物实验观察将30只小鼠分成3组（每组10只）,抗rTsSP1.1抗体组、旋毛虫鼠感染血清组及鼠正常血清组。将旋毛虫肌幼虫与上述3种血清（1:100）37°C孵育2h后,分别经口感染小鼠（500条/只）,感染后5 d观察肠道成虫数、形态及雌虫生殖力。8.统计分析应用Excel 2010对本实验得到的数据进行整理,运用SPSS 21.0进行统计分析,根据所用实验方法和数据类型选择相应的统计方法,包括t检验、单因素方差分析与卡方检验等。检验水准为α=0.05。结果1.旋毛虫丝氨酸蛋白酶TsSP1.1的生物信息学分析TsSP1.1基因全长1424 bp,分子量为51 k Da,编码453个氨基酸,p I为6.25,有信号肽,分泌到细胞周质,无跨膜区,在N端有一个明显的疏水区,属于丝氨酸蛋白酶。利用NCBI在线网站预测TsSP1.1结构域和酶活性位点,结果显示TsSP1.1包含一个丝氨酸蛋白酶家族的结构域,有3个酶活性位点（Asp、Ser及His）。用Bio Edit软件将TsSP1.1与其他寄生虫、小鼠和人等11个物种的丝氨酸蛋白酶的序列进行比对,发现其与旋毛虫属其他种旋毛虫同源性较高。用MEGA7软件对17个物种的丝氨酸蛋白酶进行比对及系统进化分析显示,旋毛虫与其他成囊型旋毛虫位于同一分枝。2.TsSP1.1的克隆表达及其抗原性分析SDS-PAGE分析结果发现rTsSP1.1在沉淀中存在,表明表达的rTsSP1.1为不可溶性蛋白。经His标签Ni-柱亲和纯化后的SDS-PAGE结果显示,在分子量为51 k Da处有一条单一的蛋白带,表明rTsSP1.1纯化效果较好。Western blot显示rTsSP1.1可以被旋毛虫感染鼠血清、抗rTsSP1.1免疫血清识别,不能被正常小鼠血清识别,证明rTsSP1.1具有良好的抗原性。3.TsSP1.1在旋毛虫各个虫期的表达及定位Western blot结果显示抗rTsSP1.1血清可识别旋毛虫ML、IIL、AW、NBL期粗抗原中天然的TsSP1.1,证明TsSP1.1基因在ML、IIL、AW、NBL期均有表达。收集新鲜虫体制成石蜡切片,进行IIF检测,发现在ML、IIL、AW的体表及内部器官等部位均出现亮绿色荧光,结果表明TsSP1.1基因在ML、IIL、AW 3个时期均有表达,TsSP1.1主要定位于皮层、杆状体和雌成虫的胚胎。4、rTsSP1.1酶活性测定以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物测定rTsSP1.1的酶活性,结果表明rTsSP1.1具有天然丝氨酸蛋白酶的酶活性,最适温度为45℃,最佳p H值为8.5。在p H为8.5时,rTsSP1.1可水解明胶。5、rTsSP1.1与IECs的结合及其在旋毛虫幼虫侵入IECs中的作用Far-western blot结果表明,IECs蛋白与rTsSP1.1共孵育后能被抗rTsSP1.1血清和旋毛虫感染小鼠血清识别,而小鼠成肌细胞（C2C12）与rTsSP1.1共孵育后不能被抗rTsSP血清和旋毛虫鼠感染血清识别。体外侵入试验结果表明,当rTsSP1.1蛋白浓度为达到5μg/m L,rTsSP1.1对幼虫侵入IECs具有显著的促进作用（χ~2=2.335,P﹤0.05）,且rTsSP1.1对幼虫侵入IECs的促进作用具rTsSP1.1蛋白剂量依赖性（r=0.939）,而且随着rTsSP1.1剂量的增高而增强（F=23.465,P<0.0001）。当血清稀释度为1:100时,抗rTsSP1.1血清、感染旋毛虫小鼠血清及正常小鼠血清组的幼虫侵入率分别为41.54%,31.63%及77.95%（P<0.01）,且抗rTsSP1.1抗体（1:100-1:800）对幼虫侵入的抑制作用具有抗体剂量依赖性（r=0.960）,随血清稀释度的增加而降低（P<0.01）,表明抗rTsSP1.1抗体可阻止幼虫对IECs的侵入。6、动物实验验证抗rTsSP1.1抗体对幼虫侵入肠黏膜及虫体发育的影响攻击感染后5 d,抗rTsSP1.1血清与旋毛虫鼠感染血清组的肠道成虫减虫率分别为26.08%、46.06%（P<0.01）,但各组的雌雄虫的差异无统计学意义（P>0.05）,提示抗rTsSP1.1抗体封闭虫体的TsSP1.1部分阻止了幼虫对肠黏膜的侵入。结论1.构建了TsSP1.1重组表达质粒p QE-80L/TsSP1.1并表达并表达纯化了rTsSP1.1。2.TsSP1.1在旋毛虫不同发育期虫体均有表达,主要定位于虫体皮层、杆状体及雌成虫胚胎。3.rTsSP1.1具有天然丝氨酸蛋白酶的酶活性,可与IECs特异性结合,对旋毛虫幼虫侵入IECs与肠黏膜有明显的促进作用。4.TsSP1.1是一种旋毛虫侵入宿主肠粘膜的相关蛋白,可作为抗旋毛虫疫苗的候选靶抗原。