论文部分内容阅读
体细胞核移植技术对畜牧业、人类生物医药及生命科学的发展起到了巨大的推动作用。但是,体细胞核移植技术的应用一直受到克隆胚胎效率低下的限制,而克隆胚胎在发育过程中发生的重编程异常是克隆胚胎发育效率低下的主要原因之一。克隆胚胎的重编程异常主要出现在DNA甲基化、组蛋白修饰、X染色体失活、基因组印迹等表观遗传修饰上。已有研究报道,X染色体失活特异转录因子(X inactive specific transcript,XIST)基因与X染色体失活密切相关,敲除小鼠和猪的XIST基因能够提高其克隆胚胎的出生率。前期研究结果表明克隆胚胎的XIST基因的差异性甲基化区域(Differentially Methylated Region,DMR)的DNA甲基化水平与其来源细胞的XISTDMR的DNA甲基化状态可能存在一定的相关性。因此本研究通过筛选具有不同XIST-DMR的DNA甲基化水平的单细胞克隆团,比较不同XIST-DMR的DNA甲基化水平的供体细胞对其克隆胚胎发育效率及囊胚期XIST-DMR的DNA甲基化水平的影响,以期建立一种通过筛选适宜的供体细胞来提高克隆效率的新方法。本研究首先通过对猪成体成纤维细胞进行单细胞接种培养获得了同一来源的34个单细胞克隆团。其次,先后使用高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)法和亚硫酸盐测序(Bisulfite Genomic Sequence,BSP)法筛选出在XIST-DMR上分别具有高、低DNA甲基化水平的两类单细胞克隆团,并通过BSP法验证了这些单细胞克隆团在冻存前及冻存复苏后其XIST-DMR的DNA甲基化水平保持不变,说明了核移植前的单细胞克隆团的XIST-DMR DNA甲基化水平与其冻存前相一致。最后,本研究通过核移植试验比较以该两类单细胞克隆团作为供体细胞制备的克隆胚胎的体外发育效率差异,发现供体细胞的XIST-DMR DNA甲基化水平对其克隆胚胎的体外发育效率无显著影响;通过比较该两类单细胞克隆团作供体细胞制备的克隆胚胎在囊胚期的XIST-DMR DNA甲基化水平,发现XIST-DMR DNA甲基化水平越低的供体细胞产生的克隆胚胎在囊胚期的XIST-DMR DNA甲基化水平越低。本研究得出以下结论:选择XIST-DMR DNA甲基化水平较低的供体细胞进行核移植无法提高其克隆胚胎的体外发育效率,但能够降低囊胚期克隆胚胎的XIST-DMR DNA甲基化水平。