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目的与意义：急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)是指由严重感染、创伤、休克和误吸等多种因素引起肺组织结构发生特征性的病理改变而出现的一种临床综合症。肺水肿为其常见的一种临床症状,主要原因是肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的损伤,肺脏的液体平衡遭到破坏,肺水屏障受损,通透性增高,肺血管与间质之间的液体交换障碍,使液体聚积于肺泡和间质间隙,导致渗透性肺水肿。抑制或减轻肺水肿可成为临床上预防或治疗ALI的一种可行方法。凉膈散载宋《太平惠民和剂局方》,为温病治疗常用名方。以往研究发现,该方有较好的抗内毒素肺损伤作用。本实验结合中医脏象理论和现代医学对ALI病机的认识,针对ALI时肺水肿的病理状态,从水的跨膜转运角度出发,通过观察凉膈散对脂多糖(lipopolysaeeharide, LPS)诱导大鼠ALI肺水肿及肺水通道蛋白(aquaporin, AQP)1、5表达的影响,来探讨该方对内毒素ALI肺水肿的保护作用及其可能作用机制,为凉膈散防治ALI提供实验依据,亦为中西医结合防治ALI提出新思路。实验方法：1动物分组及模型SPF级健康雌性Wistar大鼠156只,体重(150-180)g,随机分为对照组(ig生理盐水,iv生理盐水)、LPS组(ig生理盐水,iv LPS 5mg／kg)、LPS+3个不同剂量(7.5,15,30 g生药／kg)凉膈散组(ig 3个不同剂量凉膈散,iv LPS 5mg/kg),LPS+地塞米松组(ig DEX 0.135mg/kg, iv LPS 5mg/kg)。大鼠尾iv LPS 5mg/kg(对照组iv等体积生理盐水)复制大鼠ALI模型,其中又分为注射LPS后1、2、4、8、16h不同时相处死组,每组6只。各组大鼠每天灌胃给药1次,共给药5天后尾iv生理盐水或LPS,在相应的时间处死,取血和肺组织。2凉膈散对内毒素诱发大鼠ALI肺水肿的保护作用按照ALI模型制作方法,各组大鼠尾静脉注射生理盐水或LPS后相应的时间点腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹主动脉采集血液2ml,血液黏度测试仪(R80)分别测定150s-1,30s-1,5s-1,1s-1切变率下的全血粘度；取出大鼠肺脏,称全肺湿重,以全肺湿重与动物体重的重量百分比为肺系数(lung index, LI);剪取右上肺,称湿重(wet weight, W),然后将其放入烤箱中干燥(80℃,48h),称干重(dry weight, D),以右上肺湿重／干重(W／D)比值为肺水含量；剩余右肺放入10%甲醛中固定用作病理学观察和免疫组化,左肺组织迅速放入-80℃冰箱中保存用作免疫印迹分析(Western Blot)。3凉膈散对内毒素诱发大鼠ALI肺组织AQP-1、AQP-5表达的影响3.1免疫组化(SP)法检测肺组织AQP-1、AQP-5蛋白的分布及表达3.2免疫印迹分析(Western Blot)法检测肺组织AQP-1、AQP-5蛋白表达4统计学分析采用SPSS13.0统计软件。计量资料均用均数±标准差(x±s)表示,肺水含量、肺系数、AQP-1及AQP-5免疫组化法、AQP-1及AQP-5免疫印迹分析法检测结果比较运用析因分析,全血粘度检测结果运用重复测量的方差分析,再固定重复因素做两因素的析因分析。单独效应分析,方差齐时采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差不齐时采用Welch法,均数间多重比较,各组间方差齐采用LSD法,方差不齐采用Dunnett’s T3法,以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果：1凉膈散对内毒素诱发大鼠ALI肺水肿的保护作用1.1肺水含量(W／D)的变化各组间的W／D值有显著性差异(F=64.453,P=0.000),各个时间点的W／D值有显著性差异(F=88.758,P=0.000),组间和时间点存在交互作用(F=8.286,P=0.000)。分析各个时间点各组的单独效应,与对照组比较,LPS组大鼠W／D值在LPS诱发2h后开始显著升高(P<0.05),随后逐渐增加。与LPS组相比,2h点凉膈散高剂量组、地塞米松组及4、8、16h点凉膈散高、中、低剂量组、地塞米松组大鼠W／D值显著降低(P<0.05)。1.2肺系数(LI)的变化各组间的LI有显著性差异(F=56.477,P=0.000),各个时间点的LI有显著性差异(F=101.092,P=0.000),组间和时间点存在交互作用(F=5.912,P=0.000)。分析各个时间点各组的单独效应,与对照组比较,LPS诱导大鼠损伤后2h,LPS组大鼠LI值开始显著升高(P＜0.05),随后逐渐增加。与LPS组相比,2h点凉膈散高剂量组、地塞米松组及4、8、16h点凉膈散高、中、低剂量组、地塞米松组大鼠LI值显著降低(P<0.05)。1.3全血液粘度的变化不同切变率的血液粘度有显著性差异(F=3250.550,P=0.000),切变率与分组(F=17.984,P=0.000)和各时间点(F=54.277,P=0.000)均存在交互作用。固定切变率,逐一做分组和个时间点的析因分析,各组间血液粘度有显著性差异(150s-1,F=20.937,P=0.000；30s-1,F=19.783,P=0.000；5s-1,F=12.168,P=0.000；1s-1,F=21.364,P=0.000),各个时间点的血液粘度有显著性差异(150s-1,F=84.014,P=0.000；30s-1,F=77.053,P=0.000；5s-1,F=65.249,P=0.000；1s-1,F=70.784,P=0.000),分组与各个时间点间存在交互作用(150s-1,F=7.045,P=0.000；30s-1,F=6.578,P=0.000；5s-1,F=5.533,P=0.000；1s-1,F=6.083,P=0.000)。分析各组间的单独效应,LPS诱导大鼠损伤后,LPS组在切变率(150s-1、30s-1、5s-1)测定的全血粘度在1h、2h时均显著高于对照组(P<0.05),LPS组在切变率1s-1测定的全血粘度1h时显著高于对照组(P<0.05),LPS组在各个切变率测定下的全血粘度在4h点时与对照组比较无显著性差异,在8、16h点时,LPS组大鼠全血粘度均显著低于对照组(P<0.05)。在各个切变率测定下的全血粘度,1h点凉膈散高、中、低剂量组,2h点凉膈散高、中剂量组及4h点凉膈散高剂量组大鼠比对照组大鼠全血粘度明显升高(P<0.05),在各个切变率测定的全血粘度,地塞米松组在1、2、4h点时大鼠全血粘度相对对照组没有发生显著的变化。各个切变率测定全血粘度8h点凉膈散高、中、低剂量组、地塞米松组及16h点凉膈散高、中剂量组、地塞米松组大鼠全血粘度显著高于LPS组(P<0.05),与对照组全血粘度接近。1.4肺组织病理的改变肺大体观察,大鼠LPS致损伤后2h,双肺体积增大,明显肺水肿。随着时间的延长,肺水肿程度越来越明显,表面广泛分布斑点状红色出血灶。光镜下可见肺泡隔增厚,肺间质及肺泡水肿,出血,并有大量炎性细胞的浸润,部分肺不张,肺泡结构破坏。凉膈散各剂量组及地塞米松组镜下观察表明可不同程度的减少肺泡间隔和炎性细胞的浸润。对照组肺泡结构完整、清晰,无渗出。2凉膈散对内毒素诱发大鼠ALI肺组织AQP-1、AQP-5表达的影响2.1 AQP-1免疫组化检测结果结果显示,AQP-1主要表达于肺血管内和肺泡Ⅱ型细胞上,但主要表达于肺血管内,支气管内皮也有表达。对照组中,AQP-1呈强阳性表达,呈棕黄色。各组间的AQP-1表达有显著性差异(F=15.109,P=0.000),各个时间点的AQP-1表达有显著性差异(F=3.338,P=0.012),组间和时间点不存在交互作用(F=0.384,P=0.992)。分析各组间的主效应,对照组与LPS组AQP1的表达有显著性差异(P<0.05),与LPS组相比,凉膈散高、中、低剂量组、地塞米松组可显著增强AQP-1的表达(P＜0.05)。2.2 AQP-5免疫组化检测结果结果显示,AQP-5主要分布于肺泡Ⅰ型细胞膜表面,在正常对照组中为强阳性表达,呈棕黄色。各组间的AQP-5表达有显著性差异(F=14.056,P=0.000),各个时间点的AQP-5表达有显著性差异(F=5.831,P=0.000),组间和时间点不存在交互作用(F=0.656,P=0.863)。分析各组间的主效应,对照组与LPS组AQP-5表达有显著性差异(P<0.05),与LPS组相比,凉膈散高、中、低剂量组、地塞米松组可显著增强AQP-5的表达(P<0.05)。2.3 AQP-1 Western Blot检测结果各组间的AQP-1蛋白表达有显著性差异(F=22.822,P=0.000),各个时间点的AQP-1蛋白表达有显著性差异(F=12.152,P=0.000),组间和时间点不存在交互作用(F=0.822,P=0.684)。分析各组间的主效应,对照组与LPS组AQP-1蛋白表达有显著性差异(P＜0.05),与LPS组相比,凉膈散高、中、低剂量组、地塞米松组可显著增强AQP-1蛋白的表达(P<0.05)。2.4 AQP-5 Western Blot检测结果各组间的AQP-5蛋白表达有显著性差异(F=24.245,P=0.000),各个时间点的AQP-5蛋白表达有显著性差异(F=22.809,P=0.000),组间和时间点不存在交互作用(F=1.299,P=0.684188)。分析各组间的主效应,对照组与LPS组AQP-5蛋白表达有显著性差异(P<0.05),与LPS组相比,凉膈散高、中、低剂量组、地塞米松组可显著增强AQP-5蛋白的表达(P＜0.05)。实验结论：1内毒素诱发大鼠急性肺损伤后,大鼠肺组织肺水含量(W／D)及肺系数(LI)显著升高,凉膈散可抑制内毒素诱发大鼠急性肺损伤时肺组织肺水含量(W／D)及肺系数(LI)的升高,对内毒素诱导的大鼠急性肺损伤肺水肿有保护作用。2免疫组化及免疫印迹分析分析法检测结果提示,内毒素诱发大鼠急性肺损伤后,与对照组比较,肺组织内AQP-1, AQP-5蛋白表达减少。凉膈散可能通过上调急性肺损伤时肺组织内AQP-1, AQP-5蛋白的表达,改善液体的异常转运,使肺水肿减轻。