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研究背景与目的:病态窦房结综合征(简称病窦综合征)临床常见,对人体健康危害极大,且发病机理不清,也无有效防治措施。目前,病窦综合征的治疗以植入电子心脏起搏器为首选,但电子心脏起搏器价格昂贵、电池寿命有限、需要定期检测及更换,以及植入电子心脏起搏器可发生一些难以避免的并发症,使其应用受限。因此,探讨对病窦综合征患者窦房结结构与功能进行修复,重建一个具有正常生理功能的“生物心脏起搏器”,以取代电子心脏起搏器治疗,则是当今心脏电生理学界研究的热点之一。近年来,虽有少数将骨髓间充质干细胞(MSCs)直接或修饰后移植至生物体内以构建心脏起搏点的研究,但其结果尚不十分令人满意,其主要问题是移植细胞在体内存活时间短、心率增快不明显及心率变异性低等,表明现有的“种子细胞”尚不能满足构建“生物心脏起搏器”的需要。因此,探索寻找适合构建生物心脏起搏器的“种子细胞”,已成为当前心脏电生理学研究的重点内容之一。既往研究表明,起搏电流(funny current,If)是心脏窦房结细胞自律性产生与维持的决定因素,而超极化激活的环化核苷酸门控通道(HCN)基因家族则是If形成的分子基础。HCN基因家族包括四个成员,即HCN1～HCN4,其中HCN4与If的形成关系最为密切。为探讨mHCN4基因修饰的大鼠MSCs作为构建生物心脏起搏器“种子细胞”的可行性,本研究在国家自然科学基金(30370585)的资助下,利用本课题组在前期研究中构建的mHCN4基因逆转录病毒载体,对大鼠MSCs进行转染,并在体外诱导培养,以期获得具有自律性的心脏起搏样细胞,为构建生物心脏起搏器提供“种子细胞”。研究方法:1.以mHCN4逆转录病毒载体(pMSCV-mHCN4-EGFP)及不含mHCN4的逆转录病毒对照载体(pMSCV-EGFP)分别转染大鼠MSCs,并进行嘌呤霉素加压筛选,观察绿荧光蛋白表达情况,并以免疫细胞化学检测mHCN4基因表达,以全细胞膜片钳技术对重组mHCN4通道进行动力学测定。2.将获得的mHCN4基因修饰大鼠MSCs进行体外诱导培养,用倒置显微镜进行活细胞形态学的动态观察。3.用透射电镜观察诱导培养后细胞的超微结构,用免疫细胞化学法检测细胞α-actin、cTnT及Cx43的表达,用膜片钳技术记录细胞的动作电位。4.对转染mHCN4基因的大鼠MSCs与分离的普通心房肌细胞进行混合培养,用透射镜电观察细胞间结构连接情况;用荧光光漂白后恢复技术(FRAP)检测细胞间通讯功能状况。研究结果:1.成功将mHCN4逆转录病毒载体(pMSCV-mHCN4-EGFP)转染至大鼠MSCs,并经加压筛选获得了稳定表达mHCN4基因的大鼠MSCs。2.对获得的稳定表达mHCN4基因的大鼠MSCs进行细胞膜片钳检测,可记录到超极化激活的内向电流,其半数最大激活电压为-98.2±5.7mV,反转电位是22.5±5.2mV,在-140mV指令电位时的激活时间常数为451±61ms。该电流具有明显的时间及电压依赖特性,且对细胞外Cs+高度敏感。在相同记录条件下,仅转染pMSCV-EGFP的大鼠MSCs及未转染组大鼠MSCs均未记录到明确的超极化内向电流。3.对mHCN4基因修饰的大鼠MSCs进行诱导培养,用倒置显微镜进行活细胞观察发现,普通培养10天左右,可观察到搏动细胞出现,细胞呈长杆状,搏动频率88-318次不等,平均202±72.9次/分,单个细胞自主搏动2-3天后停止,其收缩最明显地部位出现空泡状结构。随后搏动细胞不断出现,呈集落生长,可观察到短梭形、单细胞核细胞搏动。GFP组细胞仅见少量长杆状细胞出现,未观察到细胞自主搏动,对照组细胞形态未见明显变化及细胞的自主搏动。4.选择普通培养14天的搏动细胞,用全细胞膜片钳技术检测发现,该细胞可记录到窦房结细胞样的动作电位(平均最大舒张电位为-50.9±4.8mV,平均动作电位幅度为62.9±5.2mV);5.搏动细胞经免疫细胞化学检测,该细胞不但表达mHCN4通道,同时表达心肌特异性蛋白α-actin及cTnT;透射电镜观察也发现其细胞内有明显肌丝分布,但肌丝的排列紊乱与稀少,未见肌节样结构形成,胞浆内可见丰富的颗粒、少量线粒体,其结构特点与乳鼠窦房结细胞超微结构非常相似。6.经检测mHCN4基因修饰大鼠MSCs可表达Cx43,其表达水平明显较GFP组及未转染组高,与心房肌细胞的Cx43表达水平无明显差异。7.透射电镜观察发现到mHCN4基因修饰大鼠MSCs可与相邻细胞间可形成指状交错的连接,并可观察到缝管连接的形成。.8.经荧光光漂白后恢复技术(FRAP)检测发现mHCN4阳性细胞组及mHCN4阳性细胞与心房肌细胞共培养组的平均荧光恢复率明显高于GFP阳性细胞组及GFP阳性细胞与心房肌细胞共培养组,并与心房肌细胞组相似。本研究结论:1.mHCN4可成功转染至大鼠MSCs,并可稳定持续的表达。2.mHCN4基因修饰的大鼠MSCs可记录到If,表明其已具有心脏起搏细胞的电生理特性。3.mHCN4基因修饰大鼠MSCs可在体外诱导分化为具有自律性的心脏起搏样细胞。4.mHCN4基因修饰大鼠MSCs高度表达Cx43,并可与混合培养的心房肌细胞产生缝隙连接,并存在有效的胞间通讯。