论文部分内容阅读
该实验室从黄海的深海海底泥样中筛选出一株产纤维素酶的革兰氏阴性的杆菌MB-1,它的最适生长温度为20℃,最高生长温度为40℃,在0℃也能生长,因此是典型的适冷菌.该菌所产的内切β-1,4-葡聚糖酶的最适反应温度为35℃,在10℃下仍有较高的酶活,属于适冷酶,最适反应pH值为6.0,属于酸性酶.细菌的16S rDNA序列具有两端保守,中间可变的特点,根据可变区可对其进行分类鉴定,利用16S rDNA序列鉴定细菌已经成为一个广泛而有效的方法.该文克隆和分析了海洋细菌MB-1的16S rDNA序列,将其鉴定为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas),命名为Pseudoalteromonas sp.MB-1,同时对Pseudoalteromonas sp.MB-1的16S rDNA序列进行了系统发育树分析.交替假单胞菌属是1995年根据16S rDNA序列的特点从交替单胞菌属(Alteromonas)中分离出来的一个属,目前对它的研究还不多,因此,对Pseudoalteromonas sp.MB-1做进一步的研究是很有意义的.采用PCR技术克隆了编码Pseudoalteromonas sp.MB-1的适冷内切β-1,4-葡聚糖酶酶基因celA.测序结果表明celA长1479bp,编码492个氨基酸.对CelA进行了同源模建.根据同源性分析,判断其氨基酸序列1~27aa为信号肽,28-328aa为催化结构域,329-427aa为链接区,428-492aa为底物结合结构域.把celA连入质粒pGEX-4T-1,构建了表达质粒pGEX-celA,在大肠杆菌BL21中进行表达.采用37℃培养,18℃诱导的方法,使celA基因在大肠杆菌BL21中成功进行了表达.在菌体破碎后的发酵液上清中,表达的融合蛋白GST-CelA大约占总蛋白含量的4﹪,浓度大约为0.572mg/ml,进一步分析融合酶GST-CelA的性质并与Pseudoalteromonas sp.MB-1所产野生型内切β-1,4-葡聚糖酶进行比较,发现其最适反应温度仍为35℃,属于适冷酶;最适反应pH值由6.0升高到7.2,变成了中性酶,而且融合酶GST-CelA更耐酸碱性的变化,因此说融合酶GST-CelA更具有应用的优势.该文实验结果为进一步开展Pseudoalteromonas sp.MB-1适冷酶的基础理论研究和应用研究奠定了良好的基础;为探讨适冷酶结构与功能的关系提供了一些有价值的数据;对从分子水平进一步了解适冷纤维素酶的适冷机制提供了材料和奠定了基础.