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目的：
本研究检测microRNA(miR)-17在脓毒症患者外周血中的表达，初步评价它与脓毒症疾病发生的关系。另外，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)可作为体外实验的模型细胞，用来研究血管内皮细胞的生物学特性及其与各种疾病的关系。本研究利用内毒素的主要成分-细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激HUVEC细胞来模拟脓毒症发生时人体内环境下的细胞状态，来探讨miR-17对ATG16L1介导的自噬过程的调节作用，揭示其在脓毒症发生和发展中可能的作用机制，并为miR-17作为候选生物标志物用于脓毒症的临床诊断和靶向药物开发提供理论支持。
实验方法：
1.miR-17在脓毒症患者和体外LPS刺激的HUVEC细胞中的表达量变化
本实验纳入35例脓毒症患者和20例健康对照人群，利用实时荧光定量PCR检测研究对象外周血血清中miR-17的相对表达水平。用LPS(2μg/ml)刺激HUVEC细胞，模拟脓毒症发生时患者体内环境下的细胞状态，24小时后测定细胞中miR-17表达水平。
2.LPS刺激状态下miR-17对HUVEC细胞功能的影响
首先，利用LPS处理HUVEC，模拟脓毒症患者体内细胞状态；然后在LPS刺激的HUVEC中转染miR-17mimics及其阴性对照，用CCK-8方法测定细胞活力变化。随即用Transwell分析法测定miR-17mimics转染后迁移细胞数量的变化、流式细胞分析技术检测细胞凋亡。此外，用腺病毒包裹RFP-GFP双荧光标记的LC3基因并感染细胞，激光共聚焦显微镜观察自噬体和溶酶体的数量，并用westernblot试验测定活性形式的LC3蛋白(LC3-II)的表达水平来评估细胞自噬情况。
3.miR-17与ATG16L1的相互作用研究
Westernblot检测miR-17过表达后细胞内自噬相关蛋白ATG16L1的相对表达量变化。利用Targetscan工具预测ATG16L1和miR-17可能的相互作用位点，并进行双荧光素酶报告基因实验验证二者是否存在直接作用关系：将ATG16L1编码基因的3’-UTR结合序列突变型(MUT)与野生型(WT)克隆到荧光载体上，分别与miR-17mimics共同转染HEK293T细胞，观察荧光素酶活性变化。
4.研究ATG16L1基因对HUVEC细胞生物学行为的影响
首先在HUVEC细胞中转染pc-ATG16L1、sh-ATG16L1以过表达、干扰ATG16L1基因。继而进行CCK-8实验、Transwell、流式细胞分析和激光共聚焦显微镜观察，评估细胞活力、凋亡、迁移以及自噬水平的变化。最后，细胞中共转染miR-17mimics和pc-ATG16L1，试图逆转由miR-17过表达而导致的ATG16L1水平下降，进行功能回复实验：检测细胞活力、凋亡、迁移以及自噬水平的变化。
实验结果：
1.脓毒症患者外周血中及LPS刺激的HUVEC细胞中miR-17升高
定量PCR结果显示，脓毒症患者外周血中miR-17的表达量明显高于正常受试者。在LPS处理后，体外培养的HUVEC细胞中miR-17表达水平大幅上升，是对照组的4倍以上。
2.miR-17过表达可以抑制HUVEC细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡
与对照组相比，miR-17mimics转染HUVEC细胞后，48小时之后细胞活力显著降低(P<0.05)；并且Transwell实验中迁移的HUVEC细胞数明显减少(P<0.05)；流式细胞分析显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。
3.miR-17过表达抑制了HUVEC细胞的自噬活性
激光共聚焦显微镜显示miR-17mimics组的自噬体和溶酶体数量均低于miR-NC阴性对照组(P<0.05)。miR-17过表达组的细胞中LC3-II表达水平较低，LC3-II与LC3-I的比值显著低于miR-NC组(P<0.05)。结果表明，miR-17过表达可以抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、自噬，诱导其凋亡。
4.miR-17能够直接靶向结合ATG16L1基因并抑制其表达
与miR-NC对照组相比，miR-17mimics转染明显降低了ATG16L1的表达水平。通过预测，ATG16L13’-UTR与miR-17之间存在保守的互补结合位点，双荧光素酶报告基因实验分析显示miR-17mimics和野生型质粒共转染的细胞荧光值明显低于对照组(P<0.05)，而miR-17mimics与突变型质粒共转染的细胞荧光值与对照组相比无显著差异(P>0.05)。这些结果表明，miR-17能够与ATG16L1基因的3’-UTR发生直接结合且靶向抑制其表达进而发挥作用。
5.ATG16L1表达对HUVEC细胞生物学行为的影响
在HUVEC细胞中过表达ATG16L1基因可以使细胞活力较对照组增加；而经过siATG16L1转染48小时后，细胞增殖速度受到明显抑制(P<0.05)。类似地，Transwell分析显示ATG16L1过表达组中迁移细胞数量较阴性对照组明显增加；干扰ATG16L1使细胞迁移率减少(P<0.05)。另一方面，ATG16L1的下调促进了HUVEC细胞的凋亡(P<0.05)、引起自噬体和溶酶体数目都明显低于对照组(P<0.05)和LC3Ⅱ活性形式的比例下降，而上调ATG16L1的表达可以得到相反的结果。这些数据表明，干扰ATG16L1的表达可以降低血管内皮细胞增殖和迁移的同时又促进了细胞的凋亡和自噬水平，模拟了miR-17过表达对细胞的影响，暗示miR-17可能通过下调其靶基因ATG16L1的表达从而发挥其生物学效应。
6.功能回复实验验证miR-17通过调控ATG16L1发挥其生物学效应
在细胞中同时过表达ATG16L1和miR-17可以避免miR-17引起的细胞增殖能力下降，使细胞活力与对照组相似；相比于单纯转染miR-17mimics质粒的细胞，迁移能力亦有显著提高；而与之相反地，细胞凋亡程度较单纯过表达miR-17组明显下降(P<0.01)；另外我们发现ATG16L1可以使miR-17引起的自噬水平降低有所改善，因此可以得出结论：miR-17通过下调ATG16L1使细胞生物学行为发生变化，而上调ATG16L1的表达可以反转这种作用。
实验结论：
综上所述，miRNA-17通过与ATG16L1直接相互作用并靶向抑制其表达，并且抑制了血管内皮细胞增殖、迁移和自噬并促进凋亡，从而进一步加强LPS诱导的HUVEC细胞损伤。这些结果表明，miRNA-17可能是脓毒症发病机制中的一个重要调节因子，可以用于诊断和治疗的一个新的生物标志物。
本研究检测microRNA(miR)-17在脓毒症患者外周血中的表达，初步评价它与脓毒症疾病发生的关系。另外，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)可作为体外实验的模型细胞，用来研究血管内皮细胞的生物学特性及其与各种疾病的关系。本研究利用内毒素的主要成分-细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激HUVEC细胞来模拟脓毒症发生时人体内环境下的细胞状态，来探讨miR-17对ATG16L1介导的自噬过程的调节作用，揭示其在脓毒症发生和发展中可能的作用机制，并为miR-17作为候选生物标志物用于脓毒症的临床诊断和靶向药物开发提供理论支持。
实验方法：
1.miR-17在脓毒症患者和体外LPS刺激的HUVEC细胞中的表达量变化
本实验纳入35例脓毒症患者和20例健康对照人群，利用实时荧光定量PCR检测研究对象外周血血清中miR-17的相对表达水平。用LPS(2μg/ml)刺激HUVEC细胞，模拟脓毒症发生时患者体内环境下的细胞状态，24小时后测定细胞中miR-17表达水平。
2.LPS刺激状态下miR-17对HUVEC细胞功能的影响
首先，利用LPS处理HUVEC，模拟脓毒症患者体内细胞状态；然后在LPS刺激的HUVEC中转染miR-17mimics及其阴性对照，用CCK-8方法测定细胞活力变化。随即用Transwell分析法测定miR-17mimics转染后迁移细胞数量的变化、流式细胞分析技术检测细胞凋亡。此外，用腺病毒包裹RFP-GFP双荧光标记的LC3基因并感染细胞，激光共聚焦显微镜观察自噬体和溶酶体的数量，并用westernblot试验测定活性形式的LC3蛋白(LC3-II)的表达水平来评估细胞自噬情况。
3.miR-17与ATG16L1的相互作用研究
Westernblot检测miR-17过表达后细胞内自噬相关蛋白ATG16L1的相对表达量变化。利用Targetscan工具预测ATG16L1和miR-17可能的相互作用位点，并进行双荧光素酶报告基因实验验证二者是否存在直接作用关系：将ATG16L1编码基因的3’-UTR结合序列突变型(MUT)与野生型(WT)克隆到荧光载体上，分别与miR-17mimics共同转染HEK293T细胞，观察荧光素酶活性变化。
4.研究ATG16L1基因对HUVEC细胞生物学行为的影响
首先在HUVEC细胞中转染pc-ATG16L1、sh-ATG16L1以过表达、干扰ATG16L1基因。继而进行CCK-8实验、Transwell、流式细胞分析和激光共聚焦显微镜观察，评估细胞活力、凋亡、迁移以及自噬水平的变化。最后，细胞中共转染miR-17mimics和pc-ATG16L1，试图逆转由miR-17过表达而导致的ATG16L1水平下降，进行功能回复实验：检测细胞活力、凋亡、迁移以及自噬水平的变化。
实验结果：
1.脓毒症患者外周血中及LPS刺激的HUVEC细胞中miR-17升高
定量PCR结果显示，脓毒症患者外周血中miR-17的表达量明显高于正常受试者。在LPS处理后，体外培养的HUVEC细胞中miR-17表达水平大幅上升，是对照组的4倍以上。
2.miR-17过表达可以抑制HUVEC细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡
与对照组相比，miR-17mimics转染HUVEC细胞后，48小时之后细胞活力显著降低(P<0.05)；并且Transwell实验中迁移的HUVEC细胞数明显减少(P<0.05)；流式细胞分析显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。
3.miR-17过表达抑制了HUVEC细胞的自噬活性
激光共聚焦显微镜显示miR-17mimics组的自噬体和溶酶体数量均低于miR-NC阴性对照组(P<0.05)。miR-17过表达组的细胞中LC3-II表达水平较低，LC3-II与LC3-I的比值显著低于miR-NC组(P<0.05)。结果表明，miR-17过表达可以抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、自噬，诱导其凋亡。
4.miR-17能够直接靶向结合ATG16L1基因并抑制其表达
与miR-NC对照组相比，miR-17mimics转染明显降低了ATG16L1的表达水平。通过预测，ATG16L13’-UTR与miR-17之间存在保守的互补结合位点，双荧光素酶报告基因实验分析显示miR-17mimics和野生型质粒共转染的细胞荧光值明显低于对照组(P<0.05)，而miR-17mimics与突变型质粒共转染的细胞荧光值与对照组相比无显著差异(P>0.05)。这些结果表明，miR-17能够与ATG16L1基因的3’-UTR发生直接结合且靶向抑制其表达进而发挥作用。
5.ATG16L1表达对HUVEC细胞生物学行为的影响
在HUVEC细胞中过表达ATG16L1基因可以使细胞活力较对照组增加；而经过siATG16L1转染48小时后，细胞增殖速度受到明显抑制(P<0.05)。类似地，Transwell分析显示ATG16L1过表达组中迁移细胞数量较阴性对照组明显增加；干扰ATG16L1使细胞迁移率减少(P<0.05)。另一方面，ATG16L1的下调促进了HUVEC细胞的凋亡(P<0.05)、引起自噬体和溶酶体数目都明显低于对照组(P<0.05)和LC3Ⅱ活性形式的比例下降，而上调ATG16L1的表达可以得到相反的结果。这些数据表明，干扰ATG16L1的表达可以降低血管内皮细胞增殖和迁移的同时又促进了细胞的凋亡和自噬水平，模拟了miR-17过表达对细胞的影响，暗示miR-17可能通过下调其靶基因ATG16L1的表达从而发挥其生物学效应。
6.功能回复实验验证miR-17通过调控ATG16L1发挥其生物学效应
在细胞中同时过表达ATG16L1和miR-17可以避免miR-17引起的细胞增殖能力下降，使细胞活力与对照组相似；相比于单纯转染miR-17mimics质粒的细胞，迁移能力亦有显著提高；而与之相反地，细胞凋亡程度较单纯过表达miR-17组明显下降(P<0.01)；另外我们发现ATG16L1可以使miR-17引起的自噬水平降低有所改善，因此可以得出结论：miR-17通过下调ATG16L1使细胞生物学行为发生变化，而上调ATG16L1的表达可以反转这种作用。
实验结论：
综上所述，miRNA-17通过与ATG16L1直接相互作用并靶向抑制其表达，并且抑制了血管内皮细胞增殖、迁移和自噬并促进凋亡，从而进一步加强LPS诱导的HUVEC细胞损伤。这些结果表明，miRNA-17可能是脓毒症发病机制中的一个重要调节因子，可以用于诊断和治疗的一个新的生物标志物。