本文采用基因工程手段将Bt基因导入两种重要的生防真菌木霉菌和毛壳菌中,构建了兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,为研究和开发新型微生物农药奠定理论基础.丝状真菌的遗传转化通常采用的是PEG-CaCl<,2>介导的原生质体法,但由于该方法具有操作繁杂、转化效率低、遗传不稳定等问题,在实验中探讨了将用于植物遗传转化的根癌农杆菌介导的转化系统在这两种丝状真菌上的应用,并成功地建立了相应的遗传转化系统,使转化效率提高了约50倍,从根本上解决了用传统转化方法所面临的问题.以木霉菌为研究对象,对影响根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化效率的主要因素进行了分析.为了将来自细菌的Bt基因转入生防真菌中,并得到有效表达,我们分别构建了两个含有Bt基因cry1Ab的表达载体pEBH和pPBH,前者适用于传统的PEG-CaCl<,2>介导的原生质体转化系统,后者适用于根癌农杆菌介导的遗传转化系统.通过对各转化子Southern杂交分析表明,Bt基因已整合到木霉菌和毛壳菌基因组DNA上,而且多为单拷贝方式整合.RT-PCR分析结果显示,Bt基因在转录水平上都得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.采用与植物病原菌室内拮抗实验,检测了木霉菌各转化子的抑菌活性.结果表明无论是采用传统的原生质体转化系统,还是采用根癌农杆菌介导的转化系统,所获得转化子在抑菌活性上,与木霉菌原菌都没有明显差别,对四种植物病原菌都表现出良好的拮抗作用.在拮抗机制上也同木霉菌原菌一样,主要表现为竞争和重寄生作用.这充分表明,Bt基因的导入和表达没有使木霉菌的抗病能力下降.通过人工饲虫法,以玉米螟二龄幼虫为供试昆虫,检测了木霉菌和毛壳菌以及它们的转化子的杀虫活性,结果表明,采用两种转化系统获得的木霉菌转化子都表现出了一定的杀虫活性,平均较正死亡率都达到70%以上,而且采用这两种转化系统所获得的转化子在杀虫活性上没有明显差异.本文采用基因工程手段将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab导入生防真菌木霉菌和毛壳菌中,使构建的工程菌株既保持了出发菌株原有的抑菌活性,又表现了对玉米螟的杀虫活性,为研究和开放高效微生物农药奠定了理论基础.在转化方法上,将用于植物遗传转化的根癌农杆菌系统用于丝状真菌的遗传转化,从根本上解决了传统丝状真菌遗传转化所面临的各种问题.根癌农杆菌介导的遗传转化具有转化率高、低拷贝、遗传稳定、操作简便等优点,因此有可能成为丝状真菌遗传转化和功能基因组研究的有力工具.