目的：富集同种异体兔外周血间充质干细胞(PB-MSCs),采用液氮冷冻方法制备兔股骨头坏死模型,经股骨头原位注射的方法将PB-MSCs移植到股骨头局部缺血坏死部位,继而观察移植疗效,为评价外周血作为股骨头坏死组织损伤修复的供体细胞新来源提供有价值的实验依据。方法：(1)兔PB-MSCs的分离、培养与免疫表型鉴定：选用2-3月龄新西兰大白兔,按30μg/(kg-d)剂量连续背部皮下注射G-CSF动员6d,第7d取兔外周血20mL,采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,用含20%FBS的LG-DMEM,于37℃、5%CO2饱和湿度环境下进行PB-MSCs原代培养,适时换液并弃除未贴壁的血细胞,当贴壁细胞生长汇合度达80%～90%时,按2～5×105/ml细胞密度进行传代培养。取第2代细胞,分别用流式细胞术(CD2、CD14)和免疫细胞化学染色法(CD90、CD105、CD44、CD34、CD45)对分离培养的兔PB-MSCs进行表型鉴定。(2)兔股骨头坏死模型的制备：采用成年新西兰大白兔,3%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉动物(剂量为30mg/kg),无菌条件下手术逐层分离臀肌以显露股骨头；棉签蘸取液氮,对股骨头软骨面负重区进行反复冷冻、复温以制备股骨头坏死模型。(3)动物实验分组与细胞移植：实验分为正常对照组、模型组、髓心减压组和髓心减压+PB-MSCs移植组。液氮冷冻后,用直径1.2mm钻头从髓心减压组和髓心减压+PB-MSCs移植组两组动物股骨颈的内后侧与股骨颈方向呈30度角手动钻入股骨头内5mm,到达关节软骨下,髓心减压组钻孔后,随即复位股骨头；髓心减压+PB-MSCs移植组钻孔后,注射入用400μL生理盐水悬浮的第2～3代PB-MSCs(含细胞总数3～4×106个)；术后逐层关闭各组动物创口。(5)移植效果评价：于术后2w、4w、6w、8w随机选取各组实验动物,进行髋关节X线摄片,以检测骨密度、新生骨小梁等移植后病损修复情况；摄片后分别随机选取各时间点各组实验动物股骨头,纵行剖开股骨头,一半进行固定、脱钙、常规石蜡包埋、切片(厚5μm)及HE染色,置光镜下观察组织病理学修复情况；另一部分股骨头则迅速置于液氮罐中保存,用于实时聚合酶链反应(RT-PCR),以检测不同时间点各分组股骨头PPAR-γ、BMP-2mRNA的表达情况。结果：(1)家兔PB-MSCs培养形态与表型特征：原代培养第7-8d时形成大小不等的细胞集落,细胞呈梭形、多角形及不规则形,而后集落扩大,细胞数明显增多,以梭形为主,到10d左右时,细胞生长汇合度达80%以上；传代培养的PB-MSCs形态均一,呈长梭形漩涡状生长。FCM分析结果显示PB-MSCs表达CD29,不表达CD14；免疫细胞化学染色结果显示,PB-MSCs表达CD44、CD105、 CD90,不表达CD34和CD45。(2)移植疗效的X线摄片结果：正常对照组各时间点股骨头无异常改变。模型组2w时股骨头呈现密度增高影像；4w时股骨头呈现密度不均影像,骺板尚清晰；至6w时,股骨头外形变得不规则,边缘有透亮区,关节间隙略增宽,骺板较清晰；8w时,股骨头明显塌陷,缩小,关节间隙增大,骺板模糊。股骨头大体形态随时间推移,其受损程度呈加重演变特点。髓心减压组和髓心减压+PB-MSCs移植组两组动物术后2w时股骨头密度均有所增加；4w时,两组股骨头整体密度均较2w时为增高,两组股骨头边缘密度有所增高；6w时,两组股骨头整体均表现为骨小梁结构紊乱,呈现密度不均影像,但各组标本整体密度较之前均有所增加,髓心减压+PB-MSCs移植组股骨头高密度影像清晰可见,整体密度高于髓心减压组；8w时,髓心减压组股骨头整体密度进一步增高,呈现为中心区域低密度,边缘高密度,并出现硬化线；髓心减压+PB-MSCs移植组股骨头密度整体增高,并出现正常的骨小梁结构。(3)移植疗效的组织病理学分析：正常对照组各时间点骨小梁均完整,排列规则。模型组2w时出现骨小梁断裂、排列紊乱,脂肪细胞融合成小囊；4w时髓腔内脂肪细胞出现坏死；骨小梁周围纤维组织增生；6w时修复区出现纤维化骨的爬行替代；8w时骨小梁断裂,细胞被挤压变形,可见类骨质和骨小梁等新生骨组织生成。髓心减压+PB-MSCs移植组2w时,钻孔区出现大量新生骨小梁和类骨质；4w时,两组钻孔区均出现较多新生骨小梁和骨髓组织；6w时,髓心减压组钻孔区内骨小梁已趋成熟,髓心减压+PB-MSCs移植组钻孔区出现大量的骨小梁和骨髓组织；8w时髓心减压组钻孔区边缘仍有修复现象,钻孔区内出现大量骨髓组织,骨小梁分布不均,髓心减压+PB-MSCs移植组钻孔区内骨小梁已趋成熟,并有大量骨髓组织形成。(4)PPAR-y和BMP-2表达的荧光定量PCR结果：模型组各观察时间点股骨头内PPAR-γmRNA的表达量均高于正常组(P<0.05),其中PPAR-γmRNA在造模后2-6w,随着时间的延长其表达量呈上升趋势(P<0.05)；髓心减压组PPAR-γmRNA的表达量在各时间点均明显低于模型组(P<0.01),且随着时间的延长呈现出先上升再下降的趋势,至8w时又明显上升；髓心减压+PB-MSCs移植组PPAR-y mRNA表达量随时间延长呈现出与模型组相同的趋势,但均明显低于相对应模型组的表达量；8w时,髓心减压+PB-MSCs移植组PPAR-γmRNA表达量明显低于髓心减压组(P<0.01)。模型组各时间点BMP-2mRNA的表达量明显低于正常组(P<0.01),且随着时间的延长,模型组BMP-2mRNA的表达量变化不明显；髓心减压组BMP-2mRNA的表达量明显低于相对应正常组的表达(P<0.01)；髓心减压+PB-MSCs移植组BMP-2mRNA的表达量呈现出先升高再下降而后又上升,在8w时,其表达量均明显高于相对应髓心减压组的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论：联合PB-MSCs移植对股骨头坏死的修复作用优于单纯髓心减压的修复效果,初步证实了PB-MSCs移植治疗股骨头缺血坏死的有效性；股骨头坏死PB-MSCs移植这一有益作用至少与移植PB-MSCs后进一步降低股骨头局部PPAR-γ表达,并提高BMP-2表达有关。