柑橘黄龙病(Citrus huanglongbing, HLB)是一种毁灭性的柑橘病害。可以使柑橘减产、破坏果品经济价值甚至柑橘植株死亡。该病害主要通过嫁接和木虱媒介传播,现在广泛分布于亚洲各国、印度次大陆及印度洋地区、非洲南部和最近报道的美国、巴西和古巴。其病原菌为韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter),简称柑橘黄龙病菌。柑橘黄龙病菌是一种生活在柑橘病株韧皮筛管组织以及媒介昆虫木虱体内的原核生物,分类上属于变形细菌门(Proteobacteria)α-亚纲。根据流行的地理区域、环境条件与媒介昆虫等的不同可以将柑橘黄龙病菌分成以下三个种:亚洲韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, Las)、非洲韧皮杆菌(Ca. L. africanus, Laf)和美洲韧皮杆菌(Ca. L. americanus, Lam)。其中亚洲种和美洲种通过亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)传播并具有一定的耐热性。非洲种通过非洲木虱(Trioza erytreae)传播是一种热敏感型黄龙病菌。该病原细菌至今不能进行人工纯培养,同时也没有通过科赫氏(Koch)鉴定。由于缺乏有效的杀菌剂和柑橘抗病品种,很多国家一旦发现病树只能通过根除和烧毁病树的方式阻止柑橘黄龙病的蔓延。因此对柑橘黄龙病的流行病学研究就显的尤为重要,从而为柑橘黄龙病的防治提供帮助。本研究工作的主要内容就是研究中国南部各柑橘主产区(广东、广西、浙江、福建、江西、海南等省)的亚洲韧皮杆菌的遗传多样性。采用的方法为:基于亚洲韧皮杆菌外膜蛋白(outer membrane protein gene, omp)基因的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)的方法来研究中国南部各柑橘主产区的亚洲韧皮杆菌的遗传多样性。首先采用omp基因特异性引物对扩增出来自中国南部6省的11个亚洲韧皮杆菌菌株的外膜蛋白基因并进行克隆。其次挑选每个地区具有代表性菌株的omp基因进行DNA测序,将所得的核酸序列被推导成其编码的氨基酸序列多重比对后,通过最大简约法构建系统发育树。此外还选取不同的DNA限制性内切酶消化所有亚洲韧皮杆菌的omp基因,酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分离各个条带,然后紫外成像记录不同的RFLP指纹图谱。研究结果显示:中国南部各柑橘主产区的亚洲韧皮杆菌omp基因产生的RFLP指纹图谱均不相同,这表明南方各省柑橘主产区的柑橘黄龙病菌具有一定的遗传多样性。即便在某一特定的地区(广西壮族自治区)也有一定的差异。此外通过序列分析发现中国不同地区的亚洲韧皮杆菌具有很高的同源性,其核苷酸序列的同源性高达99%,但没有发现其它种的韧皮杆菌(非洲种韧皮杆菌和美洲种韧皮杆菌)。系统发育树显示所有的韧皮杆菌被分为两大类,一类为非洲种韧皮杆菌,一类为亚洲种韧皮杆菌。这些结果对揭示中国地区的柑橘黄龙病的流行病学提供了有用的数据,并为相关部门制定科学有效的防治策略具有一定的指导意义。本研究工作的另一部分是建立一种柑橘HLB和溃疡病(CBCD)检测的多重PCR(mPCR)检测体系。先前的报道发现,在东南亚地区的很多柑橘产区都存在HLB和CBCD同时感染的情况。随着2005年在巴西和美国的佛罗里达州相继发现了柑橘HLB,这样以来同时感染柑橘HLB和CBCD的地区正逐渐增多。因此,建立早期诊断的和快速检测的体系就显得尤为必要。在这部分研究工作中,一套mPCR检测HLB和CBCD的检测体系被建立。该体系使用的特异性引物分别根据Las核糖体蛋白基因和CBCD病原菌Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac)的特异蛋白编码基因设计的。此外,还有一对根据柑橘18S rDNA保守序列设计的内参引物用作mPCR体系的内置阳性对照(IPC)。最终优化的体系能够在一次PCR反应中同时扩增193bp、253bp、382bp的三段靶序列。将mPCR体系与单重PCR进行比较,并通过测序予以证实得出:这套mPCR体系的灵敏度和特异性与单重PCR的相当。通过田间实际样品检测发现广西北海地区某些柑橘种植园被柑橘HLB和CBCD同时感染。因此该mPCR体系可以用于HLB和CBCD的检疫诊断、两种病原Las和Xac的鉴定以及用于无病苗圃种苗的快速检测。