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目的利用与新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌细胞非接触共培养法诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBM-MSCs)向心肌表型(Cardiac phenotypic cells, CPs)细胞分化,检测hBM-MSCs与Cps中微小RNA(microRNAs, miRNAs)表达谱差异,筛选诱导分化前后细胞差异性表达的miRNAs,筛选可以诱导hBM-MSCs向心肌表型分化的miRNAs,并研究其诱导分化的分子机制。方法(1)采用骨髓直接贴壁培养法分离培养hBM-MSCs。观察原代及传代细胞的形态及增殖特点,采用流式细胞术检测细胞表面标志物及诱导成脂分化等方法鉴定分离培养的hBM-MSCs。(2)用体外模拟心肌微环境,即利用非接触共培养的原代新生SD大鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular cardiomyocytes, NRVCs)诱导hBM-MSCs向Cps分化。(3)利用miRNAs表达谱芯片检测hBM-MSCs及Cps的miRNAs表达谱,筛选差异性表达的miRNAs。(4)用实时定量PCR的方法,验证芯片中上调表达的miRNAs。(5)用非接触共培养方法验证miRNA促hBM-MSCs向心肌表型细胞分化的作用,用PCR、实时定量PCR、western-bloting、流式细胞术等方法研究miRNA诱导干细胞分化的分子机制。结果(1)经骨髓贴壁法分离所得到细胞,外形呈长梭形,普通光镜下单个细胞核,核质比较大;用流式细胞术检测细胞表面标志物: CD29和CD44高表达,而CD34和CD45表达水平很低。(2)采用Transwell六孔板共培养体系:上层小室接种NRVCs,下层小室接种hBM-MSCs,共培养后可以在Cps中检测到GATA4、Nkx2.5等心肌特异性基因显著上调表达。(3)利用miRNA芯片技术检测hBM-MSCs和Cps中的miRNA表达谱,在Cps中上调表达的miRNAs(上调表达倍数大于两倍)有5个:hsa-miR-16、hsa-let-7e、hsa-miR-138、hsa-let-7a、hsa-miR-524。(4)用实时定量PCR技术对4个miRNAs:hsa-miR-16、hsa-let-7e、hsa-miR-138、hsa-miR-524进行验证,与hBM-MSCs组相比,Cps组中4个miRNAs前体的表达均显著上调。(5)在心肌细胞微环境中,过表达miR-16能显著上调hBM-MSC中GATA4、Nkx2.5、MEF2C和CTnI等心肌特异性基因的表达。(6) miR-16能促进心肌微环境中的hBM-MSCs向CPs分化,可能是通过调控CCND1,CCND2和CDK6的表达并阻滞hBM-MSCs细胞周期于G1期来实现的。结论(1)经骨髓直接贴壁法分离所得到的细胞为纯度较高的人骨髓间充质干细胞。(2)体外模拟心肌微环境可诱导hBM-MSCs向Cps分化;hBM-MSCs向Cps分化前后的miRNAs表达谱发生变化,提示差异表达的miRNAs可能参与了hBM-MSCs向Cps分化过程。(3)证实了miR-16有促进心肌微环境中的hBM-MSCs成心肌分化的作用,其中可能的机制是miR-16调控hBM-MSCs细胞周期于G1期,进而有利于心肌微环境可诱导hBM-MSCs向Cps分化。